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目的:本研究通过血管内皮生长因子165(Vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)刺激人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),检测MAPK信号通路中ERK、p38、JNK的磷酸化水平及尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator,uPA)蛋白表达变化,来研究外源性VEGF165促进HUVECs细胞uPA蛋白表达的过程中MAPK信号通路的作用。方法:1.验证VEGF165对HUVECs细胞增殖的影响:采用不同浓度的VEGF165(0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL和50 ng/mL)培养HUVECs细胞,CCK-8(水溶性四唑盐比色法)检测细胞增殖情况。2.验证VEGF165对uPA蛋白表达的影响:分别以10 ng/ml的VEGF165培养液和不含VEGF165的培养液培养HUVECs细胞,24 h,48 h,72 h后采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)法检测各组uPA蛋白的表达。3.验证VEGF165对MAPK信号通路的影响:分别以10 ng/ml的VEGF165培养基和不含VEGF165的培养基培养HUVECs细胞,0 h、6 h、12 h及24 h后WB检测各组ERK、p38、JNK磷酸化水平。4.确定与uPA蛋白表达相关的MAPK信号通路:为确认ERK信号通路在VEGF165上调uPA蛋白表达过程中的作用,我们应用该通路的特异性阻断剂PD98059干预信号传导,实验分组如下:control组,VEGF165处理组,PD98059预处理1 h组,PD98059预处理1 h+VEGF165组。WB检测uPA蛋白表达及p-ERK水平;为证实p38信号通路在VEGF165上调uPA蛋白表达过程中的作用,应用该通路的特异性阻断剂SB203580干预信号传导,实验分组同上,WB检测uPA蛋白表达及p-p38水平;为确认JNK信号通路在VEGF165上调uPA蛋白表达过程中的作用,我们应用该通路的特异性阻断剂SP600125干预信号传导,实验分组同上,WB检测uPA蛋白表达及p-JNK水平。5.验证MAPK三条通路的交互关系:分别以50 uM PD98059、20 uMSB203580和10 uM SP600125作用于HUVECs细胞,并采用WB方法检测各组ERK、p38和JNK磷酸化水平。结果:1.随VEGF165浓度增高,HUVECs细胞的光密度值(Optical Density,OD)都增高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),VEGF165浓度为10 ng/mL时OD值达到最高,继续升高VEGF165浓度,OD值无明显改变(P>0.05)。2.VEGF165刺激HUVECs细胞后,24 h、48 h、72 h uPA/GAPDH的相对强度值持续升高,差异均有统计学差异(P<0.05);对照组各时间点uPA/GAPDH值无差异(P>0.05);VEGF165组与对照组uPA/GAPDH比较,24 h无差异(P>0.05),48 h和72 h差异明显(P<0.05)。3.VEGF165培养HUVECs细胞后0 h、6 h、12 h和24 h检测,结果p-ERK水平不断增高,除0 h与6 h比较无差异,其余各时间点间差异明显(p<0.05),p-p38和p-JNK水平也不断增高,各时间点间差异明显(p<0.05);而ERK、p38和JNK总蛋白水平组间无差异(p>0.05)。对照组p-ERK、p-p38和p-JNK水平各时间点无明显变化(p>0.05)。4.分别以PD98059、SB203580和SP600125预处理1 h后用VEGF165培养HUVECs细胞,与对照组比较,只有SB203580能抑制uPA蛋白表达(p<0.05)。5.PD98059、SB203580和SP600125分别抑制ERK、p38和JNK信号通路后其余信号通路的激酶活性未见明显改变(p>0.05)。结论:1.外源性VEGF165可以促进HUVECs细胞的生长增殖,并促进细胞中uPA蛋白的表达。2.VEG165可激活MAPK的多条信号传导通路,其中p38 MAPK在VEGF165促进HUVECs细胞uPA蛋白的表达具有重要作用。