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第一部分:海马神经元的原代培养及凝血酶作用后PAR-1mRNA表达的研究。目的：探讨海马神经元的原代培养技术及凝血酶(Thrombin，TM)对海马神经元蛋白酶激活受体-1(Proteaseactivatedreceptor-1，PAR-1)mRNA表达的影响。方法：取新生大鼠海马区，应用组织消化法，加B27添加剂培养海马神经元，观察神经元的形态，采用神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specificEnolase，NSE)细胞免疫化学方法鉴定神经元的纯度。在不同浓度的TM作用海马神经元不同时间点，应用噻唑蓝(MTT)方法检测海马神经元的存活率，应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测PARmRNA的表达。结果：原代培养的海马神经元生长旺盛，经NSE鉴定神经元纯度在90％以上。不同浓度的TM作用后，海马神经元的存活率呈剂量依赖性降低，40U/mlTM组最低；TM作用后不同时间点海马神经元的存活率呈时间依赖性降低，72h组最低(p＜0.01)。原代培养海马神经元上表达三种PAR受体，即PAR1mRNA、PAR2mRNA、PAR3mRNA。1U/mlTM组海马神经元PAR-1mRNA表达增加，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.01)，随TM浓度的增加PAR-1mRNA表达逐渐增加，在40U/mlTM组达高峰(p＜0.01)。TRAP组海马神经元PAR-1mRNA表达增加，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.01)。TM作用后6hPAR-1mRNA表达开始增加，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.05)，随TM作用时间的延长而表达增强，24h时达高峰(p＜0.01)，72h维持高表达(p＜0.01)。结论：海马神经元原代培养纯度高符合实验要求。海马神经元表达三种PARmRNA。TM对海马神经元有毒性作用，与剂量及时间呈依赖关系。TM可能是通过上调及激活PAR-1受体而发挥细胞毒性作用。
第二部分:凝血酶诱导大鼠海马神经元凋亡的研究。目的：探讨不同浓度凝血酶(TM)对海马神经元凋亡的影响及其可能机制。方法：将原代培养海马神经元分为对照组、不同浓度TM(1U/ml、10U/ml、20U/ml及40U/ml)组及凝血酶受体激活肽(TRAP)组。在倒置显微镜下观察海马神经元形态的变化，用TUNEL法及流式细胞术检测海马神经元凋亡细胞数及凋亡百分率。结果：1U/mlTM组海马神经元的形态与对照组比较无明显变化。随着TM浓度增加，神经元发生明显的突起回缩，细胞间的极性消失并聚集成团，部分细胞核浓缩，染色质边集。剂量越大，改变越早越严重。1U/mlTM组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率与对照组比较差异无显著性(p＞0.05)，随着TM浓度增加，TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率呈剂量依赖性增加，与对照组比较差异有显著性(p＜0.01)。TRAP可导致细胞形态发生变化，作用与大剂量TM相似。TRAP组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率与40U/mlTM组比较差异无显著性(p＞0.05)。结论：TM可诱导海马神经元凋亡，凋亡呈剂量依赖性。TM可能是通过激活蛋白酶激活受体-1(PAR-1)介导海马神经元凋亡。第三部分凋亡调控因子在凝血酶诱导海马神经元凋亡中的作用。目的：探讨凋亡调控因子Bcl-2、Bax、JNK及Caspase-3在凝血酶(TM)诱导海马神经元凋亡中的动态变化，阐明TM诱导凋亡的机制。方法：海马神经元经40U/mlTM作用0h、6h、12h、24h、48h、72h后终止培养，应用免疫细胞化学检测Bcl-2及Bax蛋白表达，免疫印迹技术(WesternBlot)检测P-JNK、JNK及Caspase-3蛋白表达。结果：TM作用6h后，Bcl-2蛋白表达增加，与0h组相比差异有显著性(p＜0.01)，12h后开始下降，随TM作用时间的延长，Bcl-2蛋白表达水平逐渐下降，到48h达到最低值，72h后Bcl-2蛋白表达开始回升。TM作用6h后，Bax蛋白表达增加，随作用时间的延长，Bax蛋白表达水平逐渐上升，到48h达到最高值(p＜0.01)。Bcl-2/Bax比值逐渐降低，在48h小时达最低。TM作用0h时P-JNK蛋白无表达，6h后开始表达，与0h组比较差异存在显著性(p＜0.01)。P-JNK表达12h时达高峰(p＜0.01)，并持续到24h，48h后逐渐降低。0h组可见有少量JNK蛋白表达，6h后JNK表达增加(p＜0.01)，随凝血酶作用时间的延长，JNK表达无明显变化。TM作用6h后Caspase-3蛋白无明显表达，12h后Caspase-3蛋白表达开始增加，与0h组相比差异有显著性(p＜0.01)，随TM作用时间的延长，Caspase-3蛋白表达水平逐渐上升，到48h达到最高值(p＜0.01)，72h表达开始降低。结论：TM可能是通过抑制Bcl-2的表达，增强Bax的表达，降低Bcl-2和Bax的比值，进而激活JNK信号传导机制，最终激活Caspase-3导致海马神经元凋亡。
第四部分:凝血酶对海马神经元游离钙离子的影响及其机制。目的：研究凝血酶(TM)对海马神经元内游离钙离子水平的影响及其机制。方法：将原代培养海马神经元分为对照组、不同浓度TM(1U/ml、10U/ml、20U/ml、40U/ml)组、凝血酶受体激活肽(TRAP)组。MK-801和尼莫地平预处理后加入40U/mlTM。采用钙离子指示剂Fura-2荧光双波长法检测海马神经元内游离钙离子的浓度。结果：TM可使海马神经元内游离[Ca2+]i显著升高(p＜0.01)，且呈剂量依赖性。TRAP可明显升高细胞内游离[Ca2+]i。当胞外Ca2+为1.3mmol/L时，40U/mlTM可使海马神经元游离[Ca2+]i明显增加(p＜0.01)；而当胞外Ca2+为0.0mmol/L时，40U/mlTM不影响海马神经元游离[Ca2+]i。预先加入MK-801可显著降低TM的升钙作用，而预先加入尼莫地平不能抑制TM的升钙作用。结论：TM使神经细胞内游离Ca2+浓度异常升高的作用机制可能是通过激活凝血酶受体-1(PAR-1)，继而激活NMDA受体门控的Ca2+通道介导胞外Ca2+大量内流。
第五部分:凝血酶预处理对海马神经元的保护作用及其机制的研究。目的：研究凝血酶预处理(ThrombinPreconditioning，TPC)对大剂量凝血酶(TM)诱导海马神经元凋亡的影响，阐明TPC的保护作用。方法：海马神经元分别经生理盐水(Sham组)、小剂量TM(TPC组)及凝血酶受体激活肽(TRAP组)预处理48h后再加大剂量TM作用24h。采用MTT法、TUNEL法及流式细胞术检测海马神经元存活率、凋亡细胞数和凋亡百分率，应用免疫细胞化学及免疫印迹方法检测神经元Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达。结果：与Sham组比较，TPC组海马神经元的存活率明显增高(p＜0.01)，TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低(p＜0.01)，Bcl-2表达上调，Bax及Caspase-3表达明显下调(p＜0.01)。与Sham组比较，TRAP预处理组海马神经元的存活率增高(p＜0.01)，TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低(p＜0.01)，Bcl-2表达上调，Bax及Caspase-3表达明显下调(p＜0.01)。TRAP预处理组与TPC组相比差异无显著性(p＞0.05)。结论：TPC可抑制TM导致的神经细胞凋亡起保护作用。激活PAR-1，促进Bcl-2的表达和降低Bax的表达，减少Caspase-3的活化，可能是TPC抑制细胞凋亡的机制之一。