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目的：
脑出血是全世界范围威胁人类生命健康的一种严重疾病,具有高发病率、高致残率、高死亡率。然而,脑出血尚未见具有针对性的治疗手段,原因在于脑出血神经损伤的机理不明。20世纪90年代多种凝血酶受体先后被发现,凝血酶的功能得到新的认识,它除了参与凝血,还是一种细胞外信号分子,具有广泛的细胞生物学效应,而且,在高浓度时具有明显的细胞毒性。脑出血血液凝固时释放并新产生大量的凝血酶(260u-360u/ml血浆),其浓度远大于凝血酶致神经损伤的浓度(研究表明当凝血酶浓度高于5u/ml时具有神经毒性作用)。国内外研究表明,脑出血后的凝血酶与继发性神经损伤密切相关,它具有明确的神经毒性,可导致脑水肿、细胞凋亡及炎性反应等损伤。但凝血酶是如何导致脑损伤的,如何防治脑出血后凝血酶的神经毒性作用尚不清楚。我们设想脑出血产生的凝血酶也是通过其受体的介导产生神经毒性作用。目前已知的凝血酶活化受体有四种,脑出血后凝血酶通过哪种或哪几种凝血酶受体介导出血后的脑损伤?能否通过抑制这些受体的作用治疗出血性脑损伤?实验拟探讨脑出血介导神经损伤的主要凝血酶受体,并探讨人工合成小分子的凝血酶特异抑制剂Argatroban抑制该受体及防治脑出血凝血酶神经毒性作用的可能性,以期为脑出血的治疗寻找可能的有效治疗手段。实验将回答四个问题:1、脑出血后血肿周围组织表达的主要凝血酶受体是什么;2、经腹腔注射应用凝血酶的特异抑制剂Argatroban能否抑制该凝血酶受体的表达;3、经腹腔注射应用凝血酶的特异抑制剂Argatroban能否抑制脑出血后凝血酶的神经毒性作用;4.腹腔注射Argatroban是否会导致脑出血血肿扩大,即是否会有加重脑出血的副作用。
方法：
实验分成四部分进行。1、应用二次注血二次退针法建立大鼠自体血尾状核脑出血模型,实验分成脑出血组和假手术对照组。采用免疫荧光法检钡4脑出血后24h血肿周围组织及假手术对照组(尾状核区)PAR-1、PAR-2、PAR-3、及PAR-4免疫荧光阳性细胞的表达,筛选脑出血后表达的主要的凝血酶受体;2、建立大鼠自体血脑出血模型及凝血酶注入模型,实验分成对照组(sham)、脑出血组(ICH)、脑出血+argatroban干预组(ICH+Arg)、凝血酶注入组(TH),凝血酶注入+argatroban干预组(TH+Arg),其中argatroban干预为模型建立成功后3h及12h分别经腹腔注入0.9mg/kg的argatroban。应用免疫组化、westernblot及RT-PCR等方法,探讨argatroban对脑出血后及凝血酶注入后PAR-1(根据实验第一部分确定)蛋白及其基因表达的影响;3、建立大鼠自体血脑出血模型及凝血酶注入模型,模型建立方法及分组同实验第二部分。采用TUNEL、免疫组化及干湿重法,分别检测各组细胞凋亡、caspase-3、Bax蛋白及脑组织水含量,探讨argatroban对脑出血后凝血酶的神经毒性作用的干预效应;4、建立胶原酶大鼠脑出血模型,实验分为脑出血组及argatroban腹腔注射干预组,采用比色法测定血红蛋白浓度,比较argatroban对脑出血模型血肿容量的影响,探讨argatroban是否会产生血肿扩大的副作用。
结果：
1、假手术组(sham)尾状核区可见PAR-1免疫荧光阳性细胞表达,ICH组血肿周围组织PAR-1免疫荧光阳性细胞细胞数量表达明显增多,荧光更强(p＜0.05),阳性荧光主要分布于尾状核区胞膜,皮层组织轴突或树突也有表达;PAR-2阳性荧光主要分布于微血管,但出血组和对照组无显著差异,PAR-3及PAR-4在出血组及对照均无明显阳性荧光表达;2、免疫组化结果提示,脑出血或凝血酶注入后24h,PAR-1阳性细胞数明显高于假手术对照组,argatroban干预组(ICH+Arg组及TH+Arg组)PAR-1阳性细胞数明显低于非干预组(ICH组及TH组),westernblot结果提示PAR-1蛋白含量明显低于非干预组,RT-PCR结果提示PAR-1基因表达显著降低(p＜0.01或p＜0.05);3、argatroban干预后,脑出血组TLINEL阳性细胞数、Caspase-3阳性细胞数及Bax阳性细胞数明显下降(p＜0.01或p＜0.05),假手术对照组脑组织水含量百分比为75.63±1.02%,脑出血组及凝血酶注入组脑组织水含量百分比分别为:81.98±1.35%及79.32±1.08%,显著高于假手术对照组(p＜0.01);脑出血argatroban干预后,脑组织水肿含量百分比为78.02±1.24%,较非干预组明显降低(p＜0.05),凝血酶注入+argatroban干预组脑组织水肿含量百分比为76.46±1.01%,较干预前凝血酶注入组也有明显降低(p＜0.05)。4、脑出血组在550-nm波长测定的光密度值为(0.45±0.12,n=8),argatroban干预组的测得值为(0.46±0.09n=8),二者比较无统计学差异(p＞0.05)。
结论：
1、脑出血后24h主要表达的凝血酶受体为PAR-1,脑出血凝血酶可能主要通过PAR-1的介导产生神经毒性作用。
2、经腹腔注入argatroban可显著降低脑出血及凝血酶脑内注入24h后PAR-1蛋白及其基因的表达量。脑出血后PAR-1的表达与凝血酶有关,argatroban可抑制脑出血后的PAR-1表达。
3、经腹腔注入argatroban可显著降低大鼠脑出血及凝血酶脑内注入24h后TUNEL阳性细胞数量、caspase-3阳性细胞数量及Bax阳性细胞,减轻脑出血及凝血酶所致的脑水肿含量,argatroban可阻断脑出血凝血酶的神经毒性作用。
4、经腹腔注入argatroban干预,24h没有导致血肿扩大,脑出血应用argatroban防治凝血酶的神经毒性作用具有较好的安全性。