目的　　 早产儿支气管肺发育不良(bronchopulmon dysplasia,BPD)由Northway等在1967年首次提出,其发生与吸入高浓度氧、机械通气治疗、感染、动脉导管未闭、营养、遗传等因素有关。随着围产医学的迅速发展及肺表面活性物质的普遍应用,使得极低或超低出生体重儿存活率不断提高,也使BPD的发病率有不断增加的趋势。大量研究表明,在导致早产儿BPD的众多因素中,长期吸入高浓度氧气是最主要原因和最危险因素。临床上患有BPD的患儿通常因肺功能障碍需长时间依赖氧气或反复的机械通气治疗,重者多于生后1年内由于进行性呼吸衰竭,肺动脉高压而死亡,严重影响了早产儿的生活和生存质量。但由于目前BPD尚无理想的预防及治疗手段,因此探讨高氧致早产儿BPD的发病机制已成为国内外新生儿领域的热点研究。　　 尽管高氧致BPD的发生机制尚未清楚,但其病理变化已明确,即早期的肺水肿、肺组织炎症反应及晚期的肺泡发育障碍、肺间质纤维化。目前有关其发生机制的研究主要集中在晚期肺纤维化阶段,但肺纤维化一旦形成将是不可逆转的。因此探讨高氧致BPD早期的发病机制,对该病的预防及治疗尤为重要。目前高氧致BPD早期发病机制主要涉及如下方面:(1)由于早产儿肺组织抗氧化酶系统的功能不足,吸入高氧后,产生过多的氧自由基。大量氧自由基不仅能够引起肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞损伤、凋亡、坏死,同时引起肺泡毛细血管膜通透性增加,进而导致炎性损伤及肺水肿的形成。(2)细胞因子的作用。越来越多的研究表明高氧致BPD早期,细胞因子起着极为重要的作用。高氧可引起肺细胞持续产生多种细胞因子,例如:肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-8等,它们通过级联放大效应介导高氧状态下的肺部炎症反应,进而导致肺组织的炎性损伤。然而以往的研究多着重于肺组织炎症和氧化应激损伤机制,有关肺水肿的发生机制研究较少,并且应用炎症因子的拮抗剂或抗氧化剂等干预后,高氧致肺损伤的程度并没有减轻,因此本实验尝试以高氧肺损伤早期肺水肿的形成机制为切入点,试图为早产儿高氧肺损伤的防治奠定实验基础和提供理论依据。　　 近年来研究发现,实验诱导的急性肺损伤模型伴有肺上皮屏障功能的紊乱。肺泡上皮细胞间的紧密连接(tightjunction,TJ)是维持肺上皮屏障完整性的结构基础,它不仅能够控制肺上皮细胞旁钠水转运,同时也能调节肺上皮通透性以及维持肺上皮细胞的极性。Occludin蛋白是TJ相关蛋白中的特征性蛋白。大量研究表明,Occludin能够参与调节细胞旁渗透性,其表达缺失导致上皮屏障通透功能紊乱(脑,肠,睾丸),与多种疾病的发生、发展密切相关。但高氧致肺损伤早期肺水肿的形成是否与Occludin表达异常导致肺上皮屏障功能的紊乱有关,目前尚未见报道。　　 本实验以高氧致肺损伤新生鼠模型为对象,研究其肺水肿发生阶段Occludin基因及蛋白的表达变化,以及其对肺上皮屏障通透性的影响,旨在阐明紧密连接相关蛋白Occludin在高氧肺损伤早期肺水肿形成中的作用。　　 材料与方法　　 一、动物模型及分组　　 (一)研究对象及分组　　 健康成年Wistar大鼠(中国医科大学附属盛京医院动物部提供),雌鼠20只,雄鼠5只,雌雄交配(4:1),雌鼠孕21-23d自然分娩的新生鼠320只(雌雄不限),生后12小时内(0d)依据吸氧浓度.FiO2不同随机分为高氧组和空气组。　　 (二)动物模型的制备　　 将新生Wister大鼠320只依据吸入氧浓度随机分为高氧组和空气组,每组160只,雌雄不限。高氧组生后即置于氧箱中,持续输入氧气,FiO2≥0.95用测氧仪检测),CO2浓度＜0.5%(用钠石灰吸收,Dapex气体分析仪检测),温度为25～27℃,湿度60%～70%(用变色硅胶吸收水蒸汽)。每天定时开箱15min,添加水、饲料及更换垫料,每24h与空气组交换母鼠,以避免因氧中毒而致喂养能力下降。空气组置于空气环境下FiO2=0.21,具体方法及控制因素同高氧组。　　 二、标本的采集及处理　　 每组分别于实验后的1,3,5,7d随机抽取40只,用5%哥拉腹腔注射麻醉后立即打开胸腹腔。将其中10只剪断肾动脉放血活杀后,分离肺组织,左肺至于4%多聚甲醛中固定,用于观察肺组织形态学改变,右肺上叶称重后,制备成10%匀浆,测匀浆液血红蛋白量,用于计算肺血管外肺水量(extravascular lung water,EVLW),右肺中、下叶于-80℃冰箱冻存,用于Occludin基因及蛋白检测;其中10只同样放血活杀,左肺组织分离后立刻制备成5μm冰冻切片于-80℃冰箱冻存,用于免疫荧光检测,右肺处理方法同上;其中10只直接分离肺组织,用于湿重/干重比率(wet/dry weight ration,W/D)测定;另外10只大隐静脉注入FD4后气管插管,向肺内缓慢注入冷生理盐水0.5mL,然后回抽,反复操作3次,80%～90%回收,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)　　 三、实验方法及检测指标　　 1、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察肺组织病理变化　　 2、HE染色后,每个时间点每张切片按照Gustavo等方法:显微镜下(400×)选取5个视野,按照(见表1)方式对肺损伤程度进行双盲评定。　　 3、称量法测定肺组织W/D　　 4、采用Noble氏法加以改进,测定肺组织EVLW。具体公式如下:　　 每克湿肺含残血量=(匀浆液Hb/血浆Hb)×匀浆总样本量×1.055/匀浆肺重量湿肺含残血量=肺湿重×每克湿肺含残血量EVLW(ml/g)=(肺湿重.肺干重.湿肺含残血量)/肺干重　　 5、采用FD4示踪剂法测定肺上皮通透性　　 以BALF/血清FD4比值作为衡量支气管肺泡上皮通透性的指标。　　 6、免疫荧光染色法观察肺组织Occludin蛋白分布　　 7、RT-PCR检测肺组织中Occludin mRNA表达　　 8、Western Blot技术检测肺组织中Occludin蛋白水平　　 四、统计学分析　　 应用SPSS 18.0软件进行数据处理,所有数据均以(x)±s表示,采用t检验比较两组同一时间点的结果是否具有差异,多组间比较采用ANOVA分析,应用SAS9.2软件进行Spearnlan相关性分析,P＜0.05有统计学差异。　　 结果　　 一、肺组织形态学观察　　 1～7d空气组肺泡间隔逐渐变薄,肺泡结构逐渐规整;与空气组比较,高氧1d无明显变化;高氧3d可见肺泡间隔内有少量出血、水肿及中性粒细胞的浸润,肺泡间隔增厚;高氧5d肺泡间隔继续增厚,间质水肿进行性加重,中性粒细胞和红细胞浸润到肺泡腔内,可见部分肺泡壁断裂;高氧7d肺泡间隔显著增厚,红细胞碎片和蛋白水肿液充填于肺泡腔内。　　 二、急性肺损伤病理评分　　 与空气组比较,高氧1d肺损伤病理评分无明显变化(P＞0.05),高氧3d开始增加(P＜0.01),高氧7d肺损伤评分达峰值(P＜0.01)。　　 三、肺组织含水量的变化　　 与空气组比较,高氧1dW/D无明显变化(P＞0.05),高氧3d起W/D增加(P＜0.05),高氧5d、7d进行性增加(P＜0.01);与空气组比较,高氧1dEVLW无明显变化(P＞0.05),高氧3d,5d,7dEVLW进行性增加(P＜0.01)。　　 四、肺上皮通透性的变化　　 与空气组比较,高氧1dBALF/血清FD4比值无明显变化(P＞0.05),高氧3d起BALF/血清FD4比值开始增加(P＜0.05),高氧5d、7d进行性增加(P＜0.01)。　　 五、肺组织Occludin的表达　　 (一)肺组织Occludin的分布及表达　　 空气组肺组织中,在肺泡上皮细胞边缘Occludin蛋白呈现线性连续分布,并且绿色荧光强度较强,与空气组比较,其在高氧组表达稀疏、断裂,荧光强度较弱。　　 (二)肺组织Occludin mRNA表达。　　 与空气组比较,高氧1dOccludin mRNA表达无明显变化(P＞0.05),高氧3d和5dOccludin mRNA表达进行性减少(P＜0.05),高氧7d减少最明显(P＜0.01)。　　 (三)肺组织Occludin蛋白表达　　 与空气组比较,高氧1d,3dOccludin蛋白表达无明显变化(P＞0.05),高氧5d有所减少(P＜0.05),高氧7d减少最明显(P＜0.01)。　　 六、相关性分析　　 高氧致肺损伤新生鼠肺组织Occludin mRNA表达与肺上皮通透性呈现明显负相关(r=-0.706,P＜0.01);Occludin蛋白表达与肺上皮通透性呈现明显负相关(r=-0.755,P＜0.01)。　　 结论　　 新生鼠高氧暴露早期肺水肿形成阶段,肺上皮通透性逐渐增加,肺上皮紧密连接相关蛋白Occludin表达稀疏、断裂,并且不论是其基因,还是蛋白水平,均随高氧暴露时间的延长而逐渐降低,表明高氧诱导的Occludin表达下调,可能导致肺上皮通透性增加,进而参与了高氧肺损伤肺水肿的发生,发展过程。