乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可引起急性和慢性肝炎，是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生的高危因素。HBV感染将改变宿主细胞的生命过程，同时HBV亦依赖宿主细胞蛋白持续其生命周期。HBV只感染人原代肝细胞，而目前建立的所有人肝癌细胞系均不能被HBV感染。体外细胞模型的缺乏大大限制了HBV与宿主相互作用关系的研究。HepG2．2．15细胞是由高肝癌细胞HepG2衍生而来的稳定支持HBV复制、组装和分泌的细胞系，尽管缺少起始感染环节，但却是研究HBV细胞内活动过程(复制、组装和分泌等)和HBV对宿主细胞作用的良好细胞模型。因此，本研究采用比较细胞生物学的策略，运用蛋白质组学方法，系统分析HepG2．2．15与HepG2细胞蛋白复合体及分泌蛋白谱差异，以鉴定参与HBV活动的重要宿主蛋白和相关生物标志物，为治疗和诊断HBV感染相关疾病寻找新的靶点。论文分为以下两部分：一、HepG2．2．15与HepG2细胞蛋白复合体差异比较及其功能分析几乎所有的生物学过程都由蛋白复合体参与完成，在病毒．宿主相互作用中，犹为如此。分析蛋白复合体需要在自然状态下将蛋白复合体分离，近年来发展起来蓝色温和胶(blue native gel，BN Gel)电泳技术可用于分离和分析功能性蛋白复合体。本研究运用该技术检测到两个特异存在于HepG2．2．15细胞中的差异蛋白复合体，复合体经2维SDS-PAGE分离和质谱鉴定得到解析。共鉴定到24个宿主蛋白，根据其功能可分为热休克伴侣蛋白、酶、DNA／RNA结合蛋白和骨架蛋白4类。我们通过抗体超迁移和免疫共沉淀实验并结合蛋白相互作用数据库分析初步证实了差异复合体的真实性。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是进化上高度保守的蛋白家族，在生物体内起着辅助蛋白质正确折叠、组装与转运或降解的作用，与病毒生命活动亦密切相关。差异复合体1含有HSP60、HSP70和HSP90三种伴侣分子，HSP70和HSP90还同时存在于差异蛋白复合体2中。三者的表达量在HepG2和HepG2．2．15细胞中并无明显差异，但免疫共沉淀分析显示，HSP60协同HSP70和HSP90相互作用只特异存在于HepG2．2．15细胞中。资料显示HSP60、HSP70和HSP90可能参与HBV的复制和装配。但迄今为止尚无体内实验表明HSP70和HSP90对HBV的产生有辅助作用，我们用siRNA干涉HepG2．2．15细胞HSP70或HSP90的表达，结果显示下调HSP70和HSP90表达显著抑制了病毒的产生和乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达。用HSP90抑制剂(17-AAG)亦能显著抑制病毒的产生。该实验首次证实，HSP60、HSP70和HSP90以多伴侣分子复合体形式参与调节和辅助HBV的生命活动。伴侣分子可能成为HBV感染相关疾病的治疗靶点。二、HepG2与HepG2．2．15细胞分泌蛋白谱差异比较血液是发掘生物标志物的重要来源。然而，血浆中高丰度蛋白质占所有蛋白质的90％，使得直接从血浆中发现低丰度分泌蛋白质的难度极大。因此，提高疾病相关蛋白的相对丰度可能是有效寻找生物标志物的关键，从血液追溯到更临近疾病位点的体液是方法之一。这些更临近疾病位点的体液含有更丰富的从疾病组织分泌、脱落或泄漏的蛋白质或肽，而肿瘤细胞分泌蛋白成为研究肿瘤标志物更为理想的对象。本研究采用SDS-PAGE结合串联质谱分析HepG2和HepG2．2．15细胞无血清培养上清中的分泌蛋白，尝试寻找HCC，特别是HBV携带的HCC的肿瘤标志物。结果共鉴定到149个蛋白，其中HepG2．2．15细胞分泌蛋白103个，HepG2细胞分泌蛋白80个，在两种细胞中都鉴定到的有34个。对分泌蛋白进行定位和功能分类分析，发现两种细胞分泌蛋白存在明显差异，HepG2．2．15细胞分泌蛋白中参与蛋白代谢、转运和蛋白折叠的蛋白高于HepG2，HepG2细胞分泌蛋白中参与细胞信号转导和细胞生长维持的比例较高，这些差异可能是由HBV造成的；与已经发表的文章中疾病潜在标志物进行比较，发现具有一定的重叠和互补，提示了分泌蛋白用来分析肿瘤标志物的可行性。选取了AMBP、fetuin和fibronectin进行了血清学验证，提示fetuin可能成为HCC的潜在标志物。