研究背景:甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是一种可导致动物和人类罹患流行性感冒的呼吸道RNA病毒,其感染不仅造成全球每年约50万人死亡,而且可引起世界范围内周期性大流行。根据临床检测结果和尸检报告显示,细菌性共感染是导致大流行中患者重症肺炎甚至死亡的重要原因,其中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn）为检出率最高的共感染细菌之一。研究证实病毒、细菌和宿主多方面因素均可增加流感病毒感染后宿主对细菌的易感性,尤其是病毒感染引起宿主免疫反应异常,对于IAV-S.pn共感染的发生发展至关重要。但目前流感病毒对宿主免疫调控的影响尚无统一的结论,临床上仍缺乏预防和治疗细菌性共感染的免疫干预措施。颗粒蛋白前体（Progranulin,PGRN）在免疫调控中具有重要作用,可通过结合肿瘤坏死因子受体（Tumor necrosis factor receptor,TNFR）,减弱TNF-α介导的炎症反应,从而发挥抑炎效应。此外课题组前期研究发现,在脓毒症中PGRN可通过调控巨噬细胞减轻小鼠过度炎症损伤,从而提高其生存率;而在金黄色葡萄球菌感染所致肺炎中,PGRN也具有相似的作用。由此提示PGRN在感染性疾病中具有重要的免疫调控作用,可能参与调控流感病毒感染后宿主对细菌的易感性。目的:本研究将探索PGRN在IAV-S.pn共感染中的作用及机制,为寻找预防和治疗细菌性共感染的免疫干预靶点提供实验依据。方法:在冬季流感高发时期,收集来自重庆医科大学附属儿童医院的单纯IAV感染、单纯S.pn感染、IAV-S.pn共感染患儿血清标本,ELISA检查血清中PGRN的表达变化。选取实验室标准株IAV（H1N1（PR8））和S.pn（19F）,在不同时间点经鼻腔感染小鼠,建立单纯感染和共感染肺炎模型,ELISA检测PGRN在不同感染小鼠标本中的变化趋势。通过对比不同感染时WT和PGRN^-/-鼠的生存率、病毒载量、细菌载量、肺组织病理切片等结果,明确PGRN在病毒感染后宿主对细菌的易感性以及共感染导致宿主死亡中的调控作用。采用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）对小鼠肺部炎症细胞进行分类计数,同时ELISA检测肺部细胞因子和趋化因子的表达水平,明确PGRN在共感染中的免疫调控效应。体外培养小鼠的原代中性粒细胞和巨噬细胞,通过吞噬杀伤实验,分析PGRN对炎症细胞本身吞噬杀伤功能的影响。然后利用FCM、荧光TUNEL、免疫组化和Western blotting等检测手段,明确PGRN对细胞凋亡的影响,并探索参与其调控过程中的信号通路。最后通过回补外源性rPGRN蛋白,再次观察小鼠生存率、细菌载量、细胞凋亡等变化,验证PGRN在共感染中的作用。结果:1.ELISA检测结果显示,PGRN在IAV/S.pn单纯感染患儿血清中表达显著高于对照组（p<0.001,p<0.01）,而在IAV-S.pn共感染患儿血清中表达又显著高于单纯感染和对照组（p<0.001）。不同感染小鼠肺组织和血清样本中PGRN的变化趋势与临床标本基本一致,同样在PR8+19F共感染中达到最高水平。免疫组化检测结果进一步显示,PGRN在小鼠肺部的表达主要分布于肺上皮细胞和浸润的炎症细胞。2.通过肺部病原载量分析,发现WT与PGRN^-/-鼠在单纯病毒感染或共感染中肺部PR8载量无差异（p>0.05）,而在单纯细菌感染中肺部19F载量也无差异（p>0.05）,提示PGRN缺失并未影响病毒复制,且在不存在病毒感染的情况下,PGRN缺失也未影响小鼠对细菌的清除效应。但在共感染中,PGRN^-/-鼠肺部19F载量却显著高于WT鼠（p<0.05）,表明PGRN可降低流感病毒感染后小鼠对细菌的易感性。3.通过观察小鼠生存率和体重变化发现,WT与PGRN^-/-鼠在PR8/19F单纯感染中可全部存活（100%）,且体重变化无差异。但在PR8+19F共感染中,WT鼠生存率（50%）显著高于PGRN^-/-鼠（11%）（p<0.05）,且体重恢复明显加快（p<0.001）。给PGRN^-/-鼠回补rPGRN蛋白后,其在共感染中的生存率和体重恢复明显提高,可达到与WT鼠相当的水平,由此表明PGRN在PR8+19F共感染中具有重要的保护性作用。4.PGRN在共感染中抑制炎症反应,减轻小鼠肺部过度炎症损伤1)肺切片H&E染色结果显示,病毒感染中肺组织表现为水肿和少量炎症细胞浸润,而细菌感染中则表现为细支气管上皮增厚和中等炎症细胞浸润,WT与PGRN^-/-鼠在上述病理变化中均无明显差异。但在共感染中,PGRN^-/-鼠肺部出现严重坏死、肺泡结构破坏、上皮细胞脱落、出血和大量的炎症细胞浸润,其病理损伤较WT小鼠明显加重,提示PGRN可减轻小鼠在共感染中的肺组织损伤。2)通过检测肺损伤相关指标发现,PGRN^-/-鼠肺部LDH活性、总蛋白渗出和肺水肿均显著高于WT鼠（p<0.05）,且此时PGRN^-/-鼠肺部促炎型细胞因子TNF-α和IL-1β的表达也显著升高（p<0.05,p<0.01）,表明PGRN在共感染中发挥抑炎效应,可减轻小鼠肺部过度炎症损伤。5.利用FCM对小鼠肺部炎症细胞进行分类计数,结果显示WT与PGRN^-/-鼠肺部中性粒细胞（CD11b⁺Ly6G⁺）和巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺）百分比并无差异。但共感染中PGRN^-/-鼠肺部炎症细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量均显著高于WT鼠（p<0.05,p<0.01,p<0.001）,且趋化因子CXCL1和CCL2的表达也显著升高（p<0.05）,由此验证了PGRN在共感染中的抑炎效应。此外,WT与PGRN^-/-鼠肺部CD8⁺IFN-γ⁺T细胞的百分比和数量均无差异（p>0.05）,可见PGRN缺失没有影响小鼠对病毒的清除效应。6.PGRN抑制病毒感染和共感染小鼠肺部上皮和炎症细胞凋亡1)体外培养WT与PGRN^-/-鼠中性粒细胞和巨噬细胞,通过吞噬杀伤实验发现,在不存在病毒感染的情况下即单纯19F感染中,WT与PGRN^-/-两种细胞对细菌的吞噬和杀伤均无差异（p>0.05）,表明PGRN缺失对炎症细胞本身的吞噬杀伤功能无影响。2)通过FCM检测细胞凋亡,结果显示在单纯病毒感染和共感染中PGRN^-/-鼠肺部炎症细胞凋亡显著高于WT鼠（p<0.01,p<0.001）,而单纯细菌感染中WT与PGRN^-/-鼠炎症细胞凋亡无差异（p>0.05）。荧光TUNEL和Cleaved caspase-3免疫组化进一步显示,PGRN^-/-鼠肺部炎症细胞和肺上皮细胞凋亡均明显高于WT鼠,提示PGRN缺失导致小鼠在病毒感染和共感染中肺部上皮细胞和炎症细胞凋亡增加。7.PGRN通过抑制由ER stress介导的细胞凋亡,从而降低流感病毒感染后小鼠对细菌的易感性1)通过Western blotting检测发现,在病毒感染和共感染中,PGRN^-/-鼠肺部内质网应激（ER stress）反应及下游细胞凋亡信号通路（XBP1s、CHOP、JNK和Caspase-3）的激活明显高于WT鼠,提示PGRN通过抑制ER stress反应从而抑制细胞凋亡。2)采用ER stress抑制剂PBA和rPGRN处理小鼠,FCM和荧光TUNEL检测结果显示,病毒感染和共感染中经PBA或rPGRN处理的PGRN^-/-鼠,肺部上皮和炎症细胞凋亡均显著降低（p<0.05,p<0.01）,同时肺部ER stress反应及下游细胞凋亡通路的激活明显下调,证实PGRN通过抑制ER stress反应从而抑制细胞凋亡。此外,PBA或rPGRN处理的共感染PGRN^-/-鼠,肺部细菌载量和蛋白渗出也显著降低（p<0.05）。表明PGRN通过抑制由ER stress介导的细胞凋亡,从而降低流感病毒感染后小鼠对细菌的易感性。3)体外培养人肺上皮细胞A549,在PBA和rPGRN预处理后依次感染PR8和19F,FCM检测发现A549细胞凋亡较未进行预处理组显著降低（p<0.05,p<0.01,p<0.001）,Western blotting结果也进一步表明PBA和rPGRN预处理后,细胞ER stress反应及下游细胞凋亡信号通路激活明显下调,体外验证了PGRN通过抑制ER stress反应从而抑制细胞凋亡。结论:PGRN在IAV-S.pn共感染临床和小鼠标本中表达显著升高,可降低流感病毒感染后小鼠对细菌的易感性,并提高小鼠在致死性共感染中的生存率。流感病毒感染后,PGRN通过抑制细胞ER stress反应的激活,缓解病毒蛋白合成和积聚带来的细胞压力,减少过度ER stress反应介导的细胞凋亡,保护肺上皮的完整性和炎症细胞的存活,从而降低小鼠对细菌的易感性,减少共感染的发生。而PGRN在共感染中的保护效应与肺部细菌载量降低、炎症反应减弱,肺组织过度炎症损伤减轻密切相关。这种由PGRN介导的基于降低易感性和减轻宿主过度炎症损伤的免疫干预,为共感染的预防和治疗提供新的思路。