食管癌是我国常见病及高发病,全球近一半的食管癌新增和死亡病例均发生在中国,严重影响广大人民群众的健康和社会、经济发展。多数患者就诊时已为局部晚期食管癌,根治性放化疗是其主要治疗手段,但局部失败率较高。乏氧是实体瘤中普遍存在的现象,多项研究证实:食管癌中肿瘤乏氧区域的存在可导致较差的预后。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）作为乏氧相关因子,在多种癌症中表达的增加与肿瘤的发生,发展和转移密切相关,同时OPN表达水平被认为与肿瘤较差的预后相关。但能否作为食管癌乏氧增敏放射治疗疗效的预测因子尚无明确定论。乏氧诱导因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α）是乏氧诱导的放疗抵抗的核心研究分子。乳腺癌中OPN可诱导HIF-1α及血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）高表达,从而使细胞侵袭和转移能力增加。但OPN对食管癌放疗敏感性的影响及机制尚不明确。因此,本研究从临床方向,研究OPN对食管鳞癌放疗增敏疗效及预后的预测价值。并在基础研究方向,探索OPN对食管癌放疗敏感性的影响及机制,并对结果进行验证。从而对局部晚期食管鳞癌患者个体化放疗增敏提供理论依据。目的本课题通过前瞻性临床研究,分析局部晚期食管鳞癌患者OPN表达和乏氧微环境（HIF-1α、VEGF）的相关性,比较不同OPN表达患者放疗增敏的近期疗效和远期生存,评估OPN的预测价值。通过食管癌细胞体外实验,阐明OPN诱导HIF-1α高表达,对放疗敏感性的影响及作用机制。通过荷瘤鼠体内实验,比较OPN表达不同的肿瘤放疗后生长曲线的差异,以及与HIF-1α等机制分子的相关性分析,验证OPN促进HIF-1α高表达对食管鳞癌放疗敏感性的影响。方法1.本研究前瞻性入组局部晚期食管癌患者。治疗前留取患者血清样本进行OPN检测病理组织标本中免疫组化检测乏氧相关指标OPN、HIF-1α、以及VEGF表达。治疗前行全身PET-CT检查。随机分为甘氨双唑钠（Sodium glycididazole,CMN）联合根治性同步放化疗组（增敏组）和根治性同步放化疗组（对照组）。主要研究终点为客观缓解率（Objective Response Rate,ORR）,次要终点为总生存（Overall Survival,OS）、无进展生存（Progression Free Survival,PFS）和安全性分析。明确OPN对局部晚期食管鳞癌放疗增敏的指导意义。2.通过The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库,提取食管鳞癌相关数据,对比食管癌和正常组织,以及不同分期食管癌之间OPN表达差异,并通过基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）与OPN高表达密切相关的信号通路。3.筛选OPN低表达的TE-1细胞和OPN高表达的KYSE150细胞,通过流式细胞分析检测两组细胞放疗后的基线凋亡能力,通过克隆形成实验检测两组细胞在不同放疗剂量下的基线克隆形成能力。分别构建稳定转染的TE-1 oe-OPN细胞、TE-1 NC细胞和KYSE150 shOPN细胞、KYSE150 NC细胞。通过放疗后克隆形成实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后克隆形成能力的差异。通过TUNEL实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后凋亡的差异。通过蛋白免疫印迹实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后凋亡蛋白表达的差异。为明确OPN对HIF-1α蛋白表达的影响,在常氧条件下加入不同剂量重组人OPN,通过蛋白免疫印迹实验检测两组细胞HIF-1α及VEGF的表达。并通过蛋白免疫印迹实验检测上调及沉默OPN后食管癌细胞HIF-1α及VEGF的表达。HIF-1α受多条信号通路调控,PI3K和MAPK通路可能是乏氧状态下调控HIF-1α影响放疗敏感性的主要两条通路。为进一步明确OPN调控HIF-1α表达的通路分子,并深入研究分子机制。结合生物信息分析结果,给予TE-1细胞及KYSE150细胞重组人OPN培养后,选择PI3K和MAPK通路抑制剂,蛋白免疫印迹实验检测HIF-1α的表达,筛选OPN主要通过哪一个通路分子调控HIF-1α表达。并通过蛋白免疫印迹实验进一步检测该通路分子及下游分子磷酸化表达。由于乏氧是HIF-1α的主要调控因素,因此在乏氧状态下,通过蛋白免疫印迹实验检测OPN上调及沉默后HIF-1 α的表达,并通过蛋白免疫印迹实验检测通路分子的磷酸化情况,明确OPN和乏氧对HIF-1α调控的协同作用。随后,分别应用该通路分子抑制剂和重组人OPN,对TE-1 NC细胞、TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150NC细胞、KYSE150 shOPN细胞进行放疗后克隆形成能力的挽救实验,TUNEL检测放疗后各组细胞凋亡能力的恢复。4.体外实验构建的稳转TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150 shOPN细胞以及空白对照组细胞进行裸鼠成瘤。移植瘤放疗后记录肿瘤直径并计算肿瘤体积,比较不同OPN表达肿瘤放疗后生长速度和体积,验证OPN对食管癌放疗敏感性的影响。免疫组化检测不同OPN表达肿瘤组织HIF-1α、p-AKT、VEGF的表达,分析OPN和肿瘤乏氧微环境的相关性。结果1.自2016年至2018年,共入组了 78例患者,其中66例患者纳入进一步统计分析。随机分为甘氨双唑钠联合同步放化疗组（增敏组）和同步放化疗组（对照组）,两组患者之间的基线特征无明显差异。增敏组患者对CMN耐受性良好。增敏组的客观缓解率达到90.32%,对照组的客观缓解率为68.57%。两组之间差异有统计学意义χ2=4.925,P=0.027。然而两组之间的CR率（χ2=0.078,P=0.780）和PR率（χ2=2.344,P=0.126）无明显差异。随访时间截止至2019年11月,两组患者中位的总生存时间为23.37个月,95%CI 18.57-NA。增敏组的中位OS为19.93个月（95%CI 16.33-28）,而在对照组,中位OS尚未达到。增敏组的中位PFS为14.27个月（95%CI 9.57-27.77）,对照组中位PFS为16.23个月（95%CI 10.833-NA）。增敏组和对照组之间的OS（χ2=1.432,P=0.234）及PFS（χ2=0.538,P=0.464）无明显统计学差异。血清OPN相关亚组分析结果显示,入组患者血清OPN中位值为94.87ng/ml,表达范围为9.67-253.47 ng/ml。通过受试者工作特征曲线分析（Receiver operating characteristic curve,ROC）曲线分析血清 OPN 界值为 84.72ng/ml,P=0.002。血清OPN低组ORR率为89.66%,而血清OPN高组ORR率为71.80%,两组之间ORR差异无显著统计学意义（χ2=2.790,P=0.095）。血清OPN高表达患者组,在应用CMN后,较对照组的ORR明显改善（Fisher的精确检验,P=0.033）。而本身血清OPN低表达组患者,应用CMN后,与对照组ORR无差异（Fisher的精确检验,P=0.529）。生存分析结果显示血清OPN高组患者的OS（χ2=17.042,P<0.001）及PFS（χ2=13.563,P<0.001）明显低于OPN低组患者。在增敏组,OPN高表达和低表达亚组之间OS无明显差异（P>0.05）,但在对照组,OPN高表达和低表达亚组OS差异仍非常明显（P<0.001）。本研究检测了 54例入组患者食管癌病理组织的OPN、HIF-1α、VEGF的表达。结果显示组织OPN和血清OPN表达具有相关性r=0.549,P<0.001。在OPN高表达的食管鳞癌患者中,组织HIF-1α表达升高（r=0.537,P<0.001）,VEGF表达略有升高（r=0.271,P<0.050）。进一步分析组织OPN高表达组的ORR率明显低于组织OPN低表达组,差异有明显统计学意义（χ2=9.429,P=0.002）。组织高表达OPN组患者,应用CMN后,其ORR较对照组ORR明显改善（χ2=5.372,P=0.020）,但在组织低OPN表达组患者,应用CMN后,两组ORR无明显差异（Fisher的精确检验,P=1.000）。生存分析结果显示,组织OPN高表达患者的OS明显差于组织OPN低表达组患者（χ2=15.258,P<0.001）。亚组分析结果显示,在应用CMN增敏后,OPN表达的不同患者之间OS无明显差异（P>0.05）。但在对照组,组织OPN表达不同的患者OS差异仍非常明显（P<0.001）。单因素及多因素分析结果显示血清OPN、组织OPN和组织HIF-1α表达均为食管鳞癌患者预后不良的预测因素。2.通过对TCGA数据库中食管鳞癌组织和正常组织的SPP1基因（OPN的基因）表达分析,食管鳞癌中SPP1基因表达较正常组织明显升高（P<0.001）。局部晚期食管鳞癌患者的SPP1基因表达高于早期以及发生转移的晚期患者（P<0.001）。SPP1表达水平高的患者的生存率要明显差于SPP1低表达患者（P=0.004）。SPP1表达升高时,与乏氧及PI3K/AKT通路活化明显相关。3.通过筛选不同OPN表达的4种食管鳞癌细胞系,选择OPN低表达的TE-1细胞和OPN高表达的KYSE150细胞系。放疗后,两组细胞克隆形成能力均明显减低,凋亡明显增加。成功构建稳转OPN高表达的TE-1 oe-OPN细胞以及TE-1 NC细胞,同时构建稳转KYSE150-shOPN细胞和KYSE150NC细胞。TE-1 oe-OPN克隆形成率在放疗2Gy、4Gy、6Gy及8Gy剂量下较TE-1 NC和TE-1明显升高,放疗后凋亡率明显降低;而KYSE150 shOPN细胞放疗后克隆形成能力较KYSE150 NC和KYSE150明显降低,放疗后凋亡率明显升高。TE-1 oe-OPN细胞放疗后凋亡促进蛋白Bax较TE-1 NC和TE-1降低,而凋亡抑制蛋白Bcl-2升高。KYSE150-shOPN细胞放疗后Bax蛋白表达较TE-1 NC和TE-1明显升高,Bcl-2蛋白表达量明显降低。常氧及乏氧下,TE-1细胞和KYSE150细胞分别加入不同剂量人重组OPN处理后,HIF-1α及VEGF蛋白表达均升高,和OPN剂量呈正相关趋势。稳转TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150 shOPN细胞的HIF-1α蛋白表达与OPN趋势一致。PI3K抑制剂LY294002可以明显降低由OPN诱导的HIF-1α蛋白表达,且OPN高表达后,PI3K/AKT通路p-ILK、p-AKT、p-P65活性增强。放疗敏感性挽救实验显示,LY294002可以降低TE-1 oe-OPN细胞放疗后克隆形成率,升高凋亡水平,恢复至TE-1 NC水平。在KYSE150 shOPN细胞中,加入重组人OPN,可以恢复其放疗后克隆形成率及凋亡水平至KYSE150 NC水平。4.荷瘤鼠体内实验结果显示,KYSE150肿瘤对照组平均体积为1736.65±102.49 mm3。KYSE150 shOPN细胞成瘤后生长速度及体积较KYSE150及KYSE150 NC略小,但在肿瘤体积至500mm3前各组细胞肿瘤生长速度和体积差异并无统计学意义。KYSE150肿瘤放疗后平均体积为928.88±62.41 mm3,对比KYSE150 shOPN肿瘤放疗后平均体积为688.89±37.94 mm3（P<0.001）。肿瘤生长曲线结果显示在TE-1和TE-1 oe-OPN肿瘤放疗前生长速度及体积无明显差异。放疗后TE-1放疗组肿瘤平均体积为359.04±96.00,放疗后TE-1oe-OPN肿瘤平均体积为873.45±126.65 mm3,明显大于放疗后TE-1肿瘤的体积（P<0.001）。免疫组化结果显示 TE-1 oe-OPN 肿瘤的 HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34表达的强度和范围较TE-1细胞的肿瘤都明显增强。KYSE15 shOPN肿瘤的HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34表达呈明显降低的趋势。结论临床研究表明,局部晚期食管鳞癌患者中,OPN表达和食管鳞癌乏氧微环境（HIF-1α、VEGF）相关。OPN高表达患者ORR及OS较差,应用CMN增敏可改善ORR和生存。OPN对局部晚期食管鳞癌患者同步放化疗增敏疗效和预后有预测价值。体外研究发现,食管癌TE-1细胞和KYSE150细胞中,常氧下OPN高表达可导致食管鳞癌细胞PI3K/AKT通路磷酸化增强,诱导HIF-1α、VEGF蛋白表达明显升高,导致放疗抵抗。在乏氧状态下OPN诱导HIF-1 α高表达作用得到加强。PI3K抑制剂LY294002可以改善OPN高表达导致的食管鳞癌细胞放疗抵抗。体内研究证实,裸鼠食管癌模型中,OPN和乏氧微环境因子HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34的表达趋势一致。OPN高表达可以促进荷瘤鼠食管鳞癌的放疗抵抗。