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背景与目的:牙周炎是由细菌引起的慢性感染性炎症,会逐渐破坏牙周支持组织（牙槽骨、牙骨质、牙周膜及牙龈）,最终导致牙齿的松动和脱落。糖尿病是牙周炎的主要危险因素之一,可加重牙槽骨的损伤和牙周组织炎症。牙槽骨稳态的改变是糖尿病引起牙周组织损伤的重要发病机制之一。C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）一直被认为是急性炎症的标志物。最近研究发现CRP在慢性炎症和糖代谢中也发挥重要调控作用。研究发现在同时患有糖尿病和牙周炎患者的龈沟液和血液中CRP的表达显著高于单纯牙周炎的患者,而牙周健康人群CRP表达最低。但CRP在糖尿病牙周炎中仅仅作为一种标志物,还是直接参与糖尿病牙周炎的调控目前尚不清楚。PI3K/AKT信号通路参与许多生物学过程,如细胞炎症、骨组织代谢和葡萄糖代谢。最近研究表明,CRP水平与PI3K/AKT信号通路相关。然而CRP是否通过PI3K/AKT信号通路在糖尿病牙周炎中调节牙槽骨稳态尚不清楚。本研究将采用CRP基因敲除（CRP knockout,Crp KO）大鼠建立糖尿病牙周炎模型,体内验证CRP对牙槽骨稳态的影响。采用人牙周膜细胞（Human periodontal ligament cells,h PDLCs）在高糖和炎症环境中培养,体外验证CRP对h PDLCs成骨分化,成骨蛋白和破骨蛋白表达的调控作用,并探索其具体机制。本研究的目的是通过体内外实验探讨CRP在糖尿病牙周炎中的作用及其在牙槽骨稳态中的调控机制,以期为糖尿病牙周炎的治疗提供新的策略和干预靶点。方法:第一部分:将SD大鼠随机分为4组（8只/每组）:（1）对照组;（2）糖尿病组（高脂饮食+STZ注射）;（3）牙周炎组（结扎+LPS注射）;（4）糖尿病牙周炎组。通过Micro CT检测糖尿病和牙周炎对大鼠牙槽骨吸收的影响以及分析釉牙骨质界-牙槽嵴顶的距离（cementoenamel junction-alveolar bone crest,CEJ-ABC）,骨体积/总体积（bone volume/total volume,BV/TV）,骨小梁的数量（trabecular number,Tb.N）,骨小梁的厚度（trabecular thickness,Tb.Th）,以及骨小梁的分离度（trabecular separation,Tb.Sp）。苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin,HE）染色检测牙槽骨的吸收以及牙周组织的破坏情况。免疫组化检测大鼠牙周组织中CRP的表达情况。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠血清中CRP的表达情况。第二部分:本部分旨在探索CRP基因敲除在糖尿病牙周炎大鼠中对牙槽骨吸收和牙周组织破坏的影响。将CRP基因敲除（Crp KO）大鼠和SD大鼠随机分为8组（8只/每组）:（1）对照组;（2）糖尿病组;（3）牙周炎组;（4）糖尿病牙周炎组;（5）Crp KO对照组;（6）Crp KO糖尿病组;（7）Crp KO牙周炎组;（8）Crp KO糖尿病牙周炎组。通过Micro CT检测各组牙槽骨的吸收情况,并分析CEJ-ABC,BV/TV,Tb.N,Tb.Th,Tb.Sp。HE染色检测牙槽骨的吸收以及牙周组织的破坏情况。为明确CRP基因敲除在糖尿病牙周炎大鼠中对成骨以及破骨的影响。免疫组化检测破骨相关蛋白RANKL,TNF的表达,以及成骨相关蛋白OCN的表达情况。抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色检测破骨细胞及计数。第三部分:采用组织酶块消化法分离培养h PDLCs。应用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）处理和高糖培养基培养体外建立高糖炎症环境。此部分实验实验分为4组:（1）对照组;（2）高糖组;（3）LPS组;（4）高糖+LPS组。通过q RT-PCR和Western Blot（WB）分别检测高糖和LPS处理后h PDLCs中CRP基因和蛋白的表达。随后,为进一步验证CRP在高糖炎症环境中对h PDLCs成骨分化能力和成骨蛋白表达的影响,采用慢病毒敲低h PDLCs中CRP的表达,并应用q RT-PCR和WB验证敲低效率。此部分实验分为8组:（1）对照病毒组;（2）高糖+对照病毒组;（3）LPS+对照病毒组;（4）高糖+LPS+对照病毒组;（5）CRP敲低病毒组;（6）高糖+CRP敲低病毒组;（7）LPS+CRP敲低病毒组;（8）高糖+LPS+CRP敲低病毒组。采用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色检测高糖炎症环境中,CRP敲低对h PDLCs成骨分化能力的影响。随后WB检测成骨相关蛋白RUNX2,OPN,ALP,OSX,OCN,COL-1的表达情况。而后采用腺病毒过表达h PDLCs中的CRP,并应用q RT-PCR和WB验证过表达效率。此部分实验分为8组:（1）对照病毒组;（2）高糖+对照病毒组;（3）LPS+对照病毒组;（4）高糖+LPS+对照病毒组;（5）CRP过表达病毒组;（6）高糖+CRP过表达病毒组;（7）LPS+CRP过表达病毒组;（8）高糖+LPS+CRP过表达病毒组。采用ALP染色检测高糖炎症环境中,CRP过表达对h PDLCs成骨分化能力的影响。随后WB检测成骨相关蛋白RUNX2,OPN,ALP,OSX,OCN,COL-1的表达情况,进一步探索CRP过表达对早期和晚期成骨蛋白生成的作用。第四部分:本部分实验探讨CRP在高糖炎症环境中对h PDLCs破骨蛋白表达的影响。首先采用慢病毒敲低h PDLCs中CRP的表达。此实验分为8组:（1）对照病毒组;（2）高糖+对照病毒组;（3）LPS+对照病毒组;（4）高糖+LPS+对照病毒组;（5）CRP敲低病毒组;（6）高糖+CRP敲低病毒组;（7）LPS+CRP敲低病毒组;（8）高糖+LPS+CRP敲低病毒组。采用WB检测破骨相关蛋白RANKL和OPG的表达。随后,采用腺病毒过表达h PDLCs中的CRP。此部分实验分为8组:（1）对照病毒组;（2）高糖+对照病毒组;（3）LPS+对照病毒组;（4）高糖+LPS+对照病毒组;（5）CRP过表达病毒组;（6）高糖+CRP过表达病毒组;（7）LPS+CRP过表达病毒组;（8）高糖+LPS+CRP过表达病毒组。并采用WB检测破骨相关蛋白RANKL和OPG的表达。明确CRP敲低和过表达在高糖炎症环境中对h PDLCs破骨蛋白表达的影响。第五部分:探索CRP调控h PDLCs成骨和破骨蛋白表达的具体机制。采用WB检测高糖炎症环境中PI3K/AKT信号通路的表达情况,并检测CRP敲低和过表达后对该信号通路的影响。为进一步探索CRP是否通过PI3K/AKT信号通路调控h PDLCs的成骨和破骨蛋白表达,引入PI3K的抑制剂LY294002。此部分实验分为12组:（1）对照病毒组;（2）高糖+对照病毒组;（3）LPS+对照病毒组;（4）高糖+LPS+对照病毒组;（5）CRP敲低病毒组;（6）高糖+CRP敲低病毒组;（7）LPS+CRP敲低病毒组;（8）高糖+LPS+CRP敲低病毒组;（9）CRP敲低病毒组+LY294002;（10）高糖+CRP敲低病毒组+LY294002;（11）LPS+CRP敲低病毒组+LY294002;（12）高糖+LPS+CRP敲低病毒组+LY294002。WB检测PI3K/AKT信号通路的表达,以及成骨蛋白RUNX2,ALP,OCN和破骨蛋白RANKL,OPG的表达。随后引入PI3K的激动剂740Y-P。此部分实验分为12组:（1）对照病毒组;（2）高糖+对照病毒组;（3）LPS+对照病毒组;（4）高糖+LPS+对照病毒组;（5）CRP过表达病毒组;（6）高糖+CRP过表达病毒组;（7）LPS+CRP过表达病毒组;（8）高糖+LPS+CRP过表达病毒组;（9）CRP过表达病毒组+740Y-P;（10）高糖+CRP过表达病毒组+740Y-P;（11）LPS+CRP过表达病毒组+740Y-P;（12）高糖+LPS+CRP过表达病毒组+740Y-P。WB检测PI3K/AKT信号通路的表达,以及成骨蛋白RUNX2,ALP,OCN和破骨蛋白RANKL,OPG的表达。结果第一部分:Micro CT结果显示糖尿病牙周炎组大鼠牙槽骨吸收较对照组明显增加,且显著高于单纯的牙周炎组。糖尿病牙周炎组CEJ-ABC显著增加,BV/TV,Tb.N,Tb.Th显著减少,Tb.Sp显著增加。HE染色结果显示糖尿病牙周炎组牙槽骨吸收显著增加,牙周组织破坏最为严重。免疫组化结果表明糖尿病牙周炎组较对照组CRP阳性细胞增加最多,其次是单纯牙周炎组。ELISA结果显示,与对照组相比,糖尿病牙周炎组血清CRP表达最高。第二部分:Micro CT结果显示糖尿病牙周炎组大鼠牙槽骨吸收最多,Crp KO糖尿病牙周炎组牙槽骨吸收明显减少。牙周炎组也显示CRP敲除后大鼠牙槽骨的吸收显著低于未敲除组。Crp KO糖尿病牙周炎组较糖尿病牙周炎组CEJ-ABC显著降低,BV/TV,Tb.N,Tb.Th显著增加,Tb.Sp明显下降。HE染色结果提示糖尿病牙周炎组牙周组织破坏最为显著,CRP敲除后牙周组织破坏减轻。免疫组化结果表明糖尿病牙周炎组破骨相关蛋白RANKL和TNF表达显著高于对照组,而Crp KO糖尿病牙周炎组RANKL和TNF的表达减少。相反,与对照组相比,糖尿病牙周炎组成骨相关蛋白OCN表达下降最多,CRP敲除后OCN表达增加。TRAP染色结果发现糖尿病牙周炎组TRAP阳性细胞显著高于对照组,CRP敲除后TRAP阳性细胞数量显著减少。第三部分:q RT-PCR和WB结果表明高糖和LPS联合处理可以显著增加h PDLCs中CRP的表达。q RT-PCR和WB验证了CRP敲低慢病毒和CRP过表达腺病毒的敲低和过表达效率。ALP染色显示高糖和LPS处理显著抑制了h PDLCs的成骨分化能力,而CRP敲低减轻了这一抑制作用。WB结果也表明,CRP敲低减轻了高糖和LPS联合处理对成骨蛋白RUNX2、OPN、ALP、OSX、OCN和COL-1的抑制作用。相反,ALP染色和WB检测提示,CRP过表达促进了高糖和LPS对h PDLCs成骨分化和成骨蛋白表达的抑制作用。第四部分:WB结果提示高糖和LPS处理增加了细胞RANKL的表达,抑制了OPG的表达,RANKL/OPG比值增加。而CRP敲低抑制了高糖和LPS引起的RANKL/OPG比值的增加。相反,CRP过表达促进了高糖和LPS引起的RANKL/OPG比值增加。第五部分:WB结果显示,在高糖和LPS处理的h PDLCs中,PI3K和AKT的磷酸化表达降低,PI3K/AKT信号通路显著受到抑制。CRP敲低可减轻高糖和LPS对PI3K/AKT信号通路的抑制,而CRP过表达可促进高糖和LPS对该信号通路的抑制。应用PI3K的抑制剂LY294002抑制PI3K/AKT信号通路减轻了高糖炎症环境中CRP敲低对成骨蛋白RUNX2,ALP,OCN的促进作用。相反,应用PI3K的激动剂740Y-P激活PI3K/AKT信号通路减轻了高糖炎症环境中CRP过表达对成骨蛋白的抑制作用。同时,我们检测了该信号通路在高糖炎症环境中对破骨蛋白生成的影响。WB结果显示在高糖炎症环境中,应用LY294002抑制PI3K/AKT信号通路减轻了CRP敲低对破骨蛋白生成的抑制作用,然而应用740Y-P激活PI3K/AKT通路抑制了CRP过表达对破骨蛋白生成的促进作用。结论:第一部分:糖尿病牙周炎可以促进大鼠牙槽骨的吸收以及大鼠血清和牙周组织中CRP的表达。第二部分:CRP敲除可以减轻糖尿病牙周炎大鼠牙槽骨的吸收和牙周组织的破坏,在牙周组织中降低骨吸收标志物的表达和破骨细胞的数量,增加骨形成标志物的表达。第三部分:CRP在高糖炎症环境下抑制h PDLCs的成骨分化和成骨蛋白的表达。第四部分:CRP在高糖炎症环境下促进h PDLCs的破骨蛋白的表达。第五部分:CRP在高糖炎症环境中通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制h PDLCs的成骨蛋白的表达,促进破骨蛋白的表达。综上,本研究首次使用CRP基因敲除大鼠证明了CRP在糖尿病牙周炎中参与牙槽骨稳态的调控。CRP基因敲除可以减轻糖尿病牙周炎大鼠牙槽骨的吸收和破骨蛋白的表达,增加成骨蛋白的表达。CRP通过抑制PI3K/AKT通路在高糖炎症环境中抑制h PDLCs成骨蛋白的表达,促进破骨蛋白的表达。