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背景：
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种血液系统恶性肿瘤，是因为骨髓中多能造血干细胞异常而引起的，以外周血与骨髓中粒细胞异常增多为主要病症。其主要特征是形成Ph染色体(即形成BCR-ABL融化基因)，此融合基因的编码产物是一种酪氨酸激酶，可以磷酸化底物蛋白的酪氨酸残基而使其被激活，发生信号级联反应，形成信号级联复合体，致使细胞功能异常，包括细胞增殖、迁移、侵袭能力增强，凋亡减弱，细胞分化能力受抑制等。CRKL是信号接头蛋白CRK家族成员之一，含有一个SH2和两个SH3结构域，呈现SH2-SH3-SH3结构形式。它可以通过SH2和SH3的结构域来招募多种信号分子，起到信号开关的作用，在CML的发生与发展中起着重要的作用。miR-124-3p是一种高度保守的miRNA，其2-8nt是种子序列(即miRNA识别元件)，可以反向互补结合靶标分子mRNA的3’端非翻译区(mRNA-3′-UTR)或者LncRNA中的互补序列，诱导其降解或着抑制mRNA翻译从而调控靶基因的表达。近年来有文章报道miR-124-3p表达量下降与肿瘤发生发展有关，能够调控肿瘤生长、转移等。长链非编码RNA(LncRNA)是近年来的研究热点，其在转录调控，转录后加工，DNA损伤修复，染色质重组等多种生物学功能中发挥重要作用。大多数LncRNA分布在细胞核或者细胞质中，由于其分布不同作用方式也不尽相同。在胞质中的LncRNA主要的作用方式是作为竞争性内源RNA参与基因调控。竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)是一种新的调控肿瘤进展和转移的作用途径。其会涉及到lncRNA，miRNA和mRNA等分子。LncRNA与miRNAs的反应原件(MREs)结合，通过“海绵”性竞争结合miRNA，阻止其与mRNA结合，调控基因的表达，形成lncRNA-miRNA-mRNA对话调控机制。
本组前期研究发现CRKL能够抑制K562细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进细胞分化。为了研究其发挥作用的分子机制，我们用基因芯片筛选了CRKL敲降后变化的LncRNA。将筛选到的下调明显的LncRNA119766作为研究的重点。LncRNA119766是一个长度为2173bp的长链非编码RNA，位于人类7号染色体上，CRKL敲降后LncRNA119766下调明显，其可能在CRKL发挥生物学功能的过程中起到重要作用。文献报道，miR-124-3p在CML中低表达，通过生物信息学预测分析发现miR-124-3p对CRKL和LncRNA119766存在潜在的靶向负调控作用。LncRNA119766可能作为ceRNA通过“海绵”性竞争结合miR-124-3p，阻止其与CRKL结合而调控其水平变化进而调控CML的发生发展。LncRNA119766/miR-124-3p/CRKLaxis在CML中的相互关系及作用机制未见报道。
目的：
1、检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p在CML患者临床样本中的表达水平;
2、验证LncRNA119766-miR-124-3p-CRKL网络调控关系；
3、明确CRKL、miR-124-3p对K562细胞体外增殖，迁移，侵袭等细胞恶性表型的影响；
4、探讨LncRNA119766-miR-124-3p-CRKLaxis调节CML细胞恶性行为的作用机制。
方法：
1、基因芯片检测CRKL下调K562细胞中差异表达的LncRNA；
2、qRT-PCR检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p在CML患者临床样本中的表达情况，并分析三者的相关性；
3、qRT-PCR和Westernblotting(WB)检测miR-124-3p对CRKL、LncRNA119766表达水平变化的影响；
4、构建双萤光素野生型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT、psiCHECK2-LncRNA119766-WT及突变型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT、psiCHECK2-LncRNA119766-MUT重组表达载体，双萤光素酶报告实验验证miR-124-3p对CRKL-3′-UTR、LncRNA119766的靶向结合;
5、RNA免疫共沉淀(RIP)法检测AGO2抗体富集的细胞内miR-124-3p和LncRNA119766的水平，验证miR-124-3p对LncRNA119766的靶向负调控作用；
6、瞬时转染PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-CRKL、PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro于K562细胞中，qRT-PCR和WB检测CRKL的表达，并检测CRKL表达变化对miR-124-3p、LncRNA119766表达水平变化的影响；
7、瞬时转染PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-LncRNA119766和PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro至K562细胞中，qRT-PCR检测LncRNA119766表达水平及LncRNA119766过表达对miR-124-3p、CRKLmRNA表达水平变化的影响；WB检测LncRNA119766过表达对CRKL蛋白表达水平变化的影响；
8、将siLncRNA119766以及阴性对照siNC分别瞬时转染至K562细胞中，qRT-PCR检测LncRNA119766的表达水平及LncRNA119766下调对miR-124-3p、CRKLmRNA表达水平变化的影响；WB检测LncRNA119766下调对CRKL蛋白表达水平变化的影响；
9、CCK-8检测miR-124-3p，CRKL对K562细胞增殖能力的影响；
10、Transwell实验检测miR-124-3p，CRKL对K562细胞迁移，侵袭能力的影响；
12、Rescue实验验证CRKL上调是否反转miR-124-3p对K562细胞迁移的抑制作用；
13、WB检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p对PI3K/AKT通路分子表达变化的影响；
14、蛋白免疫共沉淀(Co-IP)研究CRKL与PI3K直接相互作用关系；
15、PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后，WB检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p对PI3K/AKT通路分子表达变化的影响；Transwell检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p表达水平改变引起的K562细胞迁移能力的变化。
结果：
1、通过基因芯片结果筛选，CRKL敲降后有111个LncRNA表达下调(Foldchange＜0.5)，288个LncRNA表达上调(Foldchange＞1.5)；
2、与正常人相比，CRKL、LncRNA119766在CML患者样本中表达水平升高，miR-124-3p表达水平降低；CRKL与LncRNA119766表达水平呈正相关，与miR-124-3p呈负相关，且LncRNA119766与miR-124-3p表达水平呈负相关；
3、miR-124-3p上调促进CRKLmRNA、蛋白及LncRNA119766表达水平，miR-124-3p下调抑制CRKLmRNA、蛋白及LncRNA119766表达水平；
4、双萤光素酶报告实验检测发现：与对照组相比，miR-124-3pmimic与psiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT/WT1/WT2共转染后使萤火虫萤光素酶酶活性与海肾萤光素酶的酶活性比值下降，当将两个结合位点突变后，miR-124-3p对相对双萤光素酶活性没有抑制效果，说明miR-124-3p靶向结合CRKL-3′-UTR的两个结合位点调控CRKL，CRKL是miR-124-3p的直接靶基因。同时miR-124-3p与psiCHECK2-LncRNA119766-WT、psiCHECK2-LncRNA119766-WT3共转染后使相对萤光素酶活性比值下降，将结合位点突变后，双萤光素酶相对活性相对于对照组没有变化；miR-124-3p与WT1、WT2、MUT1、MUT1共转染后相对双萤光素酶活性不受影响。说明LncRNA119766是miR-124-3p的直接靶基因，miR-124-3p主要直接靶向LncRNA119766第三个结合位点抑制LncRNA119766的表达；
5、RIP结果显示：相对于IgG抗体组，miR-124-3p和LncRNA119766在AGO2抗体组的表达明显升高,miR-124-3p能够靶向调控LncRNA119766;
6、瞬转获得CRKL过表达的细胞株，CRKL上调促进LncRNA119766表达，抑制miR-124-3p表达；CRKL下调抑制LncRNA119766表达，促进miR-124-3p表达；
7、瞬转获得LncRNA119766过表达的细胞株，LncRNA119766上调促进CRKL表达，抑制miR-124-3p表达；LncRNA119766下调抑制CRKL表达，促进miR-124-3p表达；
8、CCK-8结果表明：CRKL上调促进K562细胞增殖能力；miR-124-3p上调抑制K562细胞增殖能力，miR-124-3p下调促进K562细胞增殖能力；
9、Transwell结果表明：CRKL上调促进K562细胞的迁移，侵袭能力；miR-124-3p上调抑制K562细胞体外迁移，侵袭能力，miR-124-3p下调促进K562细胞体外迁移，侵袭能力；
10、Rescue实验结果显示：相对于miR-124-3pmimic组，miR-124-3p+PCDH-CRKL组CRKL的水平升高，细胞迁移能力增强；而相对于PCDH-CRKL组，miR-124-3p+PCDH-CRKL组CRKL的水平降低，细胞迁移能力减弱；外源性的PCDH-CRKL质粒中没有3′-UTR，miR-124-3p无法对外源性导入的CRKL起作用，只能够抑制内源性CRKL的表达，因此CRKL表达上调会逆转miR-124-3p对K562细胞迁移能力的抑制。进一步说明miR-124-3p是通过靶向负调控CRKL的表达从而发挥其生物学功能；
11、Co-IP结果表明：CRKL与PI3K直接结合。
12、CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p能够影响PI3K/AKT信号通路。CRKL、LncRNA119766下调和miR-124-3p上调均抑制PI3K、p-AKT的表达，CRKL、LncRNA119766上调和miR-124-3p下调均促进PI3K、p-AKT的表达;
13、PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后，miR-124-3p、CRKL、LncRNA119766对PI3K/AKT通路的促进作用被抑制；且CRKL、LncRNA119766上调、miR-124-3p下调对K562细胞迁移能力的促进作用被抑制。说明LncRNA119766-miR-124-3p-CRKLaxis通过PI3K/AKT通路调控K562细胞的迁移能力。
结论：
1、相较于正常人，CRKL、LncRNA119766在CML患者样本中表达水平升高，miR-124-3p表达水平降低；CRKL与LncRNA119766呈正相关，与miR-124-3p呈负相关，且LncRNA119766与miR-124-3p呈负相关；三者在临床样本水平符合ceRNA调控关系；
2、CRKL、miR-124-3p、LncRNA119766三者在K562细胞中存在ceRNA调控关系；
3、CRKL、miR-124-3p能够影响K562细胞恶性行为；
4、LncRNA119766-miR-124-3p-CRKLaxis通过调控PI3K/AKT信号通路影响K562细胞的恶性行为。
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种血液系统恶性肿瘤，是因为骨髓中多能造血干细胞异常而引起的，以外周血与骨髓中粒细胞异常增多为主要病症。其主要特征是形成Ph染色体(即形成BCR-ABL融化基因)，此融合基因的编码产物是一种酪氨酸激酶，可以磷酸化底物蛋白的酪氨酸残基而使其被激活，发生信号级联反应，形成信号级联复合体，致使细胞功能异常，包括细胞增殖、迁移、侵袭能力增强，凋亡减弱，细胞分化能力受抑制等。CRKL是信号接头蛋白CRK家族成员之一，含有一个SH2和两个SH3结构域，呈现SH2-SH3-SH3结构形式。它可以通过SH2和SH3的结构域来招募多种信号分子，起到信号开关的作用，在CML的发生与发展中起着重要的作用。miR-124-3p是一种高度保守的miRNA，其2-8nt是种子序列(即miRNA识别元件)，可以反向互补结合靶标分子mRNA的3’端非翻译区(mRNA-3′-UTR)或者LncRNA中的互补序列，诱导其降解或着抑制mRNA翻译从而调控靶基因的表达。近年来有文章报道miR-124-3p表达量下降与肿瘤发生发展有关，能够调控肿瘤生长、转移等。长链非编码RNA(LncRNA)是近年来的研究热点，其在转录调控，转录后加工，DNA损伤修复，染色质重组等多种生物学功能中发挥重要作用。大多数LncRNA分布在细胞核或者细胞质中，由于其分布不同作用方式也不尽相同。在胞质中的LncRNA主要的作用方式是作为竞争性内源RNA参与基因调控。竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)是一种新的调控肿瘤进展和转移的作用途径。其会涉及到lncRNA，miRNA和mRNA等分子。LncRNA与miRNAs的反应原件(MREs)结合，通过“海绵”性竞争结合miRNA，阻止其与mRNA结合，调控基因的表达，形成lncRNA-miRNA-mRNA对话调控机制。
本组前期研究发现CRKL能够抑制K562细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进细胞分化。为了研究其发挥作用的分子机制，我们用基因芯片筛选了CRKL敲降后变化的LncRNA。将筛选到的下调明显的LncRNA119766作为研究的重点。LncRNA119766是一个长度为2173bp的长链非编码RNA，位于人类7号染色体上，CRKL敲降后LncRNA119766下调明显，其可能在CRKL发挥生物学功能的过程中起到重要作用。文献报道，miR-124-3p在CML中低表达，通过生物信息学预测分析发现miR-124-3p对CRKL和LncRNA119766存在潜在的靶向负调控作用。LncRNA119766可能作为ceRNA通过“海绵”性竞争结合miR-124-3p，阻止其与CRKL结合而调控其水平变化进而调控CML的发生发展。LncRNA119766/miR-124-3p/CRKLaxis在CML中的相互关系及作用机制未见报道。
目的：
1、检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p在CML患者临床样本中的表达水平;
2、验证LncRNA119766-miR-124-3p-CRKL网络调控关系；
3、明确CRKL、miR-124-3p对K562细胞体外增殖，迁移，侵袭等细胞恶性表型的影响；
4、探讨LncRNA119766-miR-124-3p-CRKLaxis调节CML细胞恶性行为的作用机制。
方法：
1、基因芯片检测CRKL下调K562细胞中差异表达的LncRNA；
2、qRT-PCR检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p在CML患者临床样本中的表达情况，并分析三者的相关性；
3、qRT-PCR和Westernblotting(WB)检测miR-124-3p对CRKL、LncRNA119766表达水平变化的影响；
4、构建双萤光素野生型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT、psiCHECK2-LncRNA119766-WT及突变型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT、psiCHECK2-LncRNA119766-MUT重组表达载体，双萤光素酶报告实验验证miR-124-3p对CRKL-3′-UTR、LncRNA119766的靶向结合;
5、RNA免疫共沉淀(RIP)法检测AGO2抗体富集的细胞内miR-124-3p和LncRNA119766的水平，验证miR-124-3p对LncRNA119766的靶向负调控作用；
6、瞬时转染PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-CRKL、PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro于K562细胞中，qRT-PCR和WB检测CRKL的表达，并检测CRKL表达变化对miR-124-3p、LncRNA119766表达水平变化的影响；
7、瞬时转染PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-LncRNA119766和PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro至K562细胞中，qRT-PCR检测LncRNA119766表达水平及LncRNA119766过表达对miR-124-3p、CRKLmRNA表达水平变化的影响；WB检测LncRNA119766过表达对CRKL蛋白表达水平变化的影响；
8、将siLncRNA119766以及阴性对照siNC分别瞬时转染至K562细胞中，qRT-PCR检测LncRNA119766的表达水平及LncRNA119766下调对miR-124-3p、CRKLmRNA表达水平变化的影响；WB检测LncRNA119766下调对CRKL蛋白表达水平变化的影响；
9、CCK-8检测miR-124-3p，CRKL对K562细胞增殖能力的影响；
10、Transwell实验检测miR-124-3p，CRKL对K562细胞迁移，侵袭能力的影响；
12、Rescue实验验证CRKL上调是否反转miR-124-3p对K562细胞迁移的抑制作用；
13、WB检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p对PI3K/AKT通路分子表达变化的影响；
14、蛋白免疫共沉淀(Co-IP)研究CRKL与PI3K直接相互作用关系；
15、PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后，WB检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p对PI3K/AKT通路分子表达变化的影响；Transwell检测CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p表达水平改变引起的K562细胞迁移能力的变化。
结果：
1、通过基因芯片结果筛选，CRKL敲降后有111个LncRNA表达下调(Foldchange＜0.5)，288个LncRNA表达上调(Foldchange＞1.5)；
2、与正常人相比，CRKL、LncRNA119766在CML患者样本中表达水平升高，miR-124-3p表达水平降低；CRKL与LncRNA119766表达水平呈正相关，与miR-124-3p呈负相关，且LncRNA119766与miR-124-3p表达水平呈负相关；
3、miR-124-3p上调促进CRKLmRNA、蛋白及LncRNA119766表达水平，miR-124-3p下调抑制CRKLmRNA、蛋白及LncRNA119766表达水平；
4、双萤光素酶报告实验检测发现：与对照组相比，miR-124-3pmimic与psiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT/WT1/WT2共转染后使萤火虫萤光素酶酶活性与海肾萤光素酶的酶活性比值下降，当将两个结合位点突变后，miR-124-3p对相对双萤光素酶活性没有抑制效果，说明miR-124-3p靶向结合CRKL-3′-UTR的两个结合位点调控CRKL，CRKL是miR-124-3p的直接靶基因。同时miR-124-3p与psiCHECK2-LncRNA119766-WT、psiCHECK2-LncRNA119766-WT3共转染后使相对萤光素酶活性比值下降，将结合位点突变后，双萤光素酶相对活性相对于对照组没有变化；miR-124-3p与WT1、WT2、MUT1、MUT1共转染后相对双萤光素酶活性不受影响。说明LncRNA119766是miR-124-3p的直接靶基因，miR-124-3p主要直接靶向LncRNA119766第三个结合位点抑制LncRNA119766的表达；
5、RIP结果显示：相对于IgG抗体组，miR-124-3p和LncRNA119766在AGO2抗体组的表达明显升高,miR-124-3p能够靶向调控LncRNA119766;
6、瞬转获得CRKL过表达的细胞株，CRKL上调促进LncRNA119766表达，抑制miR-124-3p表达；CRKL下调抑制LncRNA119766表达，促进miR-124-3p表达；
7、瞬转获得LncRNA119766过表达的细胞株，LncRNA119766上调促进CRKL表达，抑制miR-124-3p表达；LncRNA119766下调抑制CRKL表达，促进miR-124-3p表达；
8、CCK-8结果表明：CRKL上调促进K562细胞增殖能力；miR-124-3p上调抑制K562细胞增殖能力，miR-124-3p下调促进K562细胞增殖能力；
9、Transwell结果表明：CRKL上调促进K562细胞的迁移，侵袭能力；miR-124-3p上调抑制K562细胞体外迁移，侵袭能力，miR-124-3p下调促进K562细胞体外迁移，侵袭能力；
10、Rescue实验结果显示：相对于miR-124-3pmimic组，miR-124-3p+PCDH-CRKL组CRKL的水平升高，细胞迁移能力增强；而相对于PCDH-CRKL组，miR-124-3p+PCDH-CRKL组CRKL的水平降低，细胞迁移能力减弱；外源性的PCDH-CRKL质粒中没有3′-UTR，miR-124-3p无法对外源性导入的CRKL起作用，只能够抑制内源性CRKL的表达，因此CRKL表达上调会逆转miR-124-3p对K562细胞迁移能力的抑制。进一步说明miR-124-3p是通过靶向负调控CRKL的表达从而发挥其生物学功能；
11、Co-IP结果表明：CRKL与PI3K直接结合。
12、CRKL、LncRNA119766、miR-124-3p能够影响PI3K/AKT信号通路。CRKL、LncRNA119766下调和miR-124-3p上调均抑制PI3K、p-AKT的表达，CRKL、LncRNA119766上调和miR-124-3p下调均促进PI3K、p-AKT的表达;
13、PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后，miR-124-3p、CRKL、LncRNA119766对PI3K/AKT通路的促进作用被抑制；且CRKL、LncRNA119766上调、miR-124-3p下调对K562细胞迁移能力的促进作用被抑制。说明LncRNA119766-miR-124-3p-CRKLaxis通过PI3K/AKT通路调控K562细胞的迁移能力。
结论：
1、相较于正常人，CRKL、LncRNA119766在CML患者样本中表达水平升高，miR-124-3p表达水平降低；CRKL与LncRNA119766呈正相关，与miR-124-3p呈负相关，且LncRNA119766与miR-124-3p呈负相关；三者在临床样本水平符合ceRNA调控关系；
2、CRKL、miR-124-3p、LncRNA119766三者在K562细胞中存在ceRNA调控关系；
3、CRKL、miR-124-3p能够影响K562细胞恶性行为；
4、LncRNA119766-miR-124-3p-CRKLaxis通过调控PI3K/AKT信号通路影响K562细胞的恶性行为。