凡纳对虾(Penaeus vannamei)，又俗称白肢虾(white-leg shrimp)或白对虾(white shrimp)，作为世界上养殖产量最高的对虾品种，具有生长速度快、抗逆性强、适应性广、饲料蛋白质含量需求低、适合集约化养殖等特点。江苏省凡纳对虾的养殖产量约占全国总产量的10%左右，是江苏省沿海滩涂开发的重要养殖品种。但是随着凡纳对虾集约化养殖的扩大，一些负面问题也随之暴露出来，如养殖对虾种质退化、水环境污染、养殖密度过大等，其中最主要的是由病原微生物引起的各种疾病的发生。近些年，虾肝肠微孢虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)的检出率一直稳居凡纳对虾病原的第一位，该病原造成对虾生长发育缓慢、规格大小不一，已成为严重威胁对虾产业的病原微生物。EHP主要寄生在对虾的肝胰腺和肠道等消化组织中，并且可以通过消化系统进行水平传播。众所周知，肝胰腺和肠道在水生甲壳动物的食物消化、营养吸收、先天免疫中发挥着重要作用，但是EHP感染对对虾肝胰腺和肠道的影响目前还不清楚。同时，相对于其他微孢子虫的研究，EHP的研究起步较晚且较薄弱，目前还主要侧重于病理学、病原检测、疾病发展与环境关系等方面的研究，而有关EHP致病机制及与肠道菌群之间关系的研究还是空白。
　　随着生物技术的发展，蛋白质组、代谢组、肠道菌群分析的出现，为我们更好地解析对虾的免疫机制、虾肝肠孢虫的分子致病机理提供了技术支持。本论文首先通过PCR技术对如东县养殖池塘中的EHP流行情况进行分析，并对EHP载量进行了检测，进而确定患病的严重程度；其次，利用差异蛋白质组学和代谢组学比较了EHP感染的对虾和健康对虾在蛋白和代谢水平的差异，以期初步分析EHP的致病机理；同时，结合代谢组、蛋白组等研究成果，通过实验验证了亚麻酸在抑制EHP繁殖、增强对虾免疫能力、增加对虾抗氧化能力的作用；然后，通过蛋白组学和肠道微生物组学探究EHP给对虾肠道及肠道微生物造成的影响，进一步解析EHP的致病机制；最后，根据肠道蛋白组和肠道微生物组的结果，克隆得到肠道组织中的三种C型凝集素，对它们的抑菌功能进行了验证。本论文从蛋白和代谢组学及肠道免疫等层面揭示了EHP侵染凡纳对虾的致病机制，为更好地防治虾肝肠孢虫病奠定理论基础。本论文研究结果主要包括以下4个部分：
　　1.凡纳对虾肝胰腺应对虾肝肠孢虫感染差异蛋白组与代谢组学分析
　　首先通过PCR和qRT-PCR对对虾体内的EHP进行定性与定量分析，发现EHP载量超过103copies/ngDNA时对虾患病严重。其次，采用TMT蛋白质组学和代谢组学方法分析了EHP诱导凡纳对虾的应答反应。差异蛋白组的结果显示EHP感染后，几种与对虾免疫相关的蛋白被显著诱导，如peritrophin-44-likeprotein、alpha2macroglobulinisoform2、prophenoloxidase-activatingenzymes、ferritin、Rab11A和cathepsinC。另外，与生长相关蛋白(如：farnesoicacido-methyltransferase、juvenilehormoneesterase-likecarboxylesterase1和ecdysteroid-regulatedprotein)的改变说明对虾生长激素的紊乱，进而影响对虾正常退壳。差异蛋白KEGG通路分析发现，与能量代谢相关的通路，如Glycolysis/gluconeogenesis和Glyoxylateanddicarboxylatemetabolism被显著富集；另外，代谢组的KEGG分析也明显富集到与能量代谢相关的通路，如Galactosemetabolism和Biosynthesisofunsaturatedfattyacids。综合蛋白组与代谢组的结果不难看出EHP通过改变对虾生长激素与能量代谢致使对虾生长发育迟缓。
　　2.亚麻酸对EHP阳性对虾生长性能和免疫指标的影响
　　代谢组的结果显示：与健康组相比，感染EHP的对虾体内亚麻酸(LNA)等24种代谢物显著减少。已有研究表明亚麻酸能促进动物生长，增强免疫力和抗氧化能力，改善肉质。因此，本章研究旨在评价亚麻酸是否能改善感染EHP对虾的生长性能和免疫指标。利用不同亚麻酸含量的饲料喂养患病对虾30天后结果显示，当添加亚麻酸量为2.4g/kg饲料时，对虾的体长和体重较其他各组显著增加。与不添加亚麻酸组相比，亚麻酸添加量为1.2、2.4、4.8g/kg组中EHP拷贝数明显减少。进一步的研究表明,2.4g/kg亚麻酸饲料喂养对虾后，与生长有关的基因(farnesoicacidO-methyltransferase和ecdysteroid-regulatedprotein)被抑制表达，同时juvenilehormoneesterase-likecarboxylesterase1表达增加，这些结果揭示添加2.4g/kg亚麻酸的饲料可以改善患病对虾的生长能力。另外，添加亚麻酸后，对虾体内的三种免疫基因(peritrophin-44-likeprotein、lysozyme和cathepsinC)显著上调。同时，不同添加浓度的亚麻酸对凡纳对虾超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性也有明显提高。这些结果指示亚麻酸可作为一种潜在的代谢调节剂来缓解EHP引起的生长迟滞的症状，为虾肝肠孢虫病的防治提供一种新的思路。
　　3.凡纳对虾肠道应对虾肝肠孢虫感染的差异蛋白组及肠道菌群分析
　　与健康对虾相比，EHP感染导致对虾肠道中263个蛋白差异表达，其中134个上调表达、129个下调表达。蛋白功能结构分析发现，下调表达的蛋白主要富集在凝集素、免疫球蛋白、血蓝蛋白、谷胱甘肽转移酶等免疫相关的结构域，暗示EHP感染导致对虾先天免疫能力减弱。KEGG通路分析发现下调蛋白主要富集在药物代谢相关通路、脂类代谢与降解、淀粉与蔗糖代谢等能量代谢相关通路，这也说明感染EHP后，凡纳对虾药物代谢、脂类和多糖的消化代谢能力都显著下降。另一方面，EHP感染增加了对虾肠道菌群的Alpha多样性，同时也导致对虾肠道菌群组成发生明显变化。进一步分析发现，EHP感染导致一些致病菌如志贺氏菌Shigella、气单胞菌属Aeromonas、粪杆菌属Faecalibacterium和链球菌属Streptococcus等菌属占比明显增加，这些条件致病菌的异常增加会进一步降低对虾的免疫能力。
　　4.三种凡纳对虾C型凝集素的功能验证
　　肠道蛋白组结果显示EHP感染导致具有C型凝集素结构的多个蛋白表达下调，同时致病菌在肠道菌群的占比升高。EHP感染后表达下调的C型凝集素是否对肠道中增加的四种致病菌有免疫能力呢？在本章中，成功克隆表达了三个下调的C型凝集素，对其抑菌功能进行了探究。通过对序列分析和预测，凡纳对虾perlucin(PvPer)的ORF区为549bp，编码182个氨基酸，含有17个氨基酸的信号肽，28个氨基酸的coiled-coil结构域和123个氨基酸组成的CLECT结构域(C型凝集素结构域)。Mannosereceptor1(PvMR1)基因具有948bp的ORF区，编码315个氨基酸，含有22个氨基酸的信号肽和两个CLECT结构域。C-typelectindomainfamily17(PvCTL17)基因含有504bp的ORF，编码167个氨基酸序列，含有一个16个氨基酸的信号肽和132个氨基酸的CLECT结构域。重组的PvPer和PvMR1蛋白都能以一种浓度依懒型的结合方式与LPS和PGN结合，但重组的PvCTL17不具有与LPS和PGN结合的能力。进一步研究发现PvPer和PvMR1在Ca2+存在的情况下能与四种致病菌(粪肠球菌Enterococcusfaecalis、志贺氏菌ShigellaCastellani、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila)结合，而PvCTL17只能与粪肠球菌和嗜水气单胞菌微弱的结合。在Ca2+存在的情况下，PvPer和PvMR1蛋白均能凝集所有被检测的细菌，PvCTL17能比较强的凝集粪肠球菌与嗜水气单胞菌，而对志贺氏菌没有凝集素能力。综上所述，具有典型的CTL结构域的PvPer、PvMR1、PvCTL17对粪肠球菌、志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、嗜水气单胞菌四种致病菌具有抑菌能力，暗示在这这三种凝集素在维持对虾肠道菌群平衡方面发挥着重要作用。