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研究背景:心房颤动(Atrial Fibrillation,AF)是一种常见的心律失常,严重影响患者的生存预期和生活质量。目前,房颤最主要的干预手段为抗心律失常药物(Antiarrhythmic Drug,A AD)及射频消融术,但存在多种不足。心房基质重构是房颤发生和维持的基础,心房纤维化是心房基质重构最主要表现形式,炎症反应为其诱发和加重因素。大量研究表明,TGF-β1/Smad3信号通路与心房纤维化密切相关,是心房纤维化相关因子的重要调控机制。房颤的危险因素可以有效促进巨噬细胞释放Galectin-3,而Galectin-3可通过参与调节成纤维细胞的激活和增殖,最终导致心脏纤维化、心脏重构,导致房颤的发生并维持房颤。因此提出参连复脉颗粒含药血洁及其有效成分小檗碱可能是通过调节TGF-β1/Smad3通路,起到抑制Galectin-3介导的促炎、促心房纤维化反应的作用的假说。研究目的:通过建立内毒素(LipopolySaccharide,LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症反应模型、LPS诱导的RAW264.7炎症反应培养液+小鼠心肌成纤维细胞(Mouse Cardiac Fibroblasts,MCFs)共培养模型,从炎症角度探讨参连复脉颗粒含药血清及其有效成分小檗碱抗心房早期纤维化的机制。第一部分:基于Galectin-3介导的TGF-β1/Smad3通路探讨参连复脉颗粒含药血清抗炎抗心房早期纤维化的机制研究方法:实验一:参连复脉颗粒含药血清对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞炎症反应的影响建立LPS诱导RAW264.7炎症反应模型,分为正常对照组、模型组、中药低浓度组、中药中浓度组、中药高浓度组、阳性药组,采用MTT法检测RAW264.7细胞活性及增殖,荧光染色双标法观察RAW264.7极化,ELISA法检测上清液中相关因子水平,Western Blot法检测通路相关蛋白的表达。实验二:参连复脉颗粒含药血清对小鼠心肌成纤维细胞纤维化相关蛋白的影响建立LPS诱导RAW264.7炎症反应培养液+MCFs共培养模型,分为正常对照组、模型组、中药低浓度组、中药中浓度组、中药高浓度组、阳性药组、Galectin-3四肽抑制剂(AC-SDKP)组,Western Blot法检测通路相关蛋白的表达。研究结果:实验一:细胞活性及增殖情况:与正常对照组比较,模型组MTTOD值显著升高(P<0.01),提示LPS可促进RAW264.7细胞增殖;与模型组比较,低浓度、高浓度含药血清组和阳性药组OD值显著下降(P<0.01),中浓度含药血清组OD值有下降趋势,但差异无统计学意义(P=0.07);与阳性药组比较,低、中、高浓度含药血清组无统计学差异(P>0.05);与中浓度含药血清组比较,低浓度、高浓度含药血清组OD值显著降低(P<0.01)。RAW264.7极化:与正常对照组比较,模型组CD163(+)/CD68(+)值显著降低(P<0.01);与模型组比较,低、中、高浓度含药血清组和阳性药组显著升高(P<0.01);与阳性药组比较,低、中、高浓度含药血清组无统计学差异(P>0.05)。CD68荧光强度:与正常对照组比较,模型组CD68荧光强度升高(P<0.05);与模型组比较,高浓度含药血清组和阳性药组强度降低(P<0.05),低浓度和中浓度含药血清组无统计学差异(P>0.05);与阳性药组比较,各含药血清组差异无统计学差异(P>0.05)。CD163荧光强度:各组间比较无统计学差异(P>0.05)。上清液炎症因子水平:Galectin-3、TNF-α水平:各组间结果比较无统计学差异(P>0.05)。IL-6水平:与正常对照组比较,模型组IL-6水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,低、中、高浓度组、阳性药组IL-6水平均显著下降(P<0.01);与阳性药组比较,低、中、高浓度组IL-6水平无统计学差异(P>0.05)。炎症因子蛋白表达水平:Galectin-3、INOS蛋白表达水平:各组间结果比较无统计学差异(P>0.05)。与正常对照组相比,模型组INOS蛋白表达水平有升高趋势(P=0.1);与模型组比较,低浓度、高浓度含药血清组INOS蛋白表达水平有降低趋势(P=0.08)。IL-6蛋白表达水平:与正常对照组相比,模型组IL-6蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,低浓度、高浓度含药血清组IL-6蛋白表达水平降低(P<0.05),阳性药组IL-6蛋白表达水平呈下降趋势,但差异无统计学意义(P=0.09),中浓度组IL-6蛋白表达水平差异无统计学差异(P>0.05);与阳性药组比较,各含药血清组差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-α蛋白表达水平:与正常对照组相比,模型组TNF-α蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,低浓度含药血清组TNF-α蛋白表达水平降低(P<0.05),中浓度、高浓度含药血清组和阳性药组TNF-α蛋白表达水平呈下降趋势,但差异无统计学意义(P=0.1)。实验二:Galectin-3、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP-3、TIMP-3 蛋白表达水平:各蛋白表达水平组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。研究结论:参连复脉颗粒含药血清可促进LPS诱导的RAW264.7细胞向M2型极化,抑制LPS诱导的炎症反应,但是否基于Galectin-3介导的TGF-β1/Smad3信号通路起到抗早期纤维化的作用有待于进一步研究。第二部分:基于网络药理学研究黄连治疗心房颤动的活性成分及作用机制研究目的:本研究拟通过网络药理学的方法,分析、预测黄连治疗房颤的药效基础、作用靶点,为阐明黄连的分子作用机制提供参考依据。研究方法:TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data-base and Analysis Platform)数据库中检索黄连所有成分及靶点,以“Atrial Fibrillation”为关键词分别检索TTD、DrugB ank、美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库,获得疾病靶点,通过Cytoscape3.2.1软件进行相关靶点可视化构建,利用 Bisogenet 插件构建相关靶点蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interactions,PPI)网络,通过Merge功能得到药物-疾病共同相关的靶点,CytoNCA插件对“成分-靶点-疾病网络”进行拓扑分析,计算出度值,进行核心网络构建与分析,利用David数据库将药物-疾病共同相关靶点进行Go注释与KEGG富集通路分析,通过OmicShare平台以高级气泡图进行可视化。研究结果:结果显示有11个活性成分可以直接或间接作用于159个靶点,5106条边,涉及20条疾病通路,其中针对房颤有效的黄连活性成分主要包括小檗碱、小檗红碱、巴马汀等,它们可能通过调节基因表达、蛋白代谢、巨核细胞分化等生物过程及 PI3K-AKT、MAPK、HIF-1、Notch、Hippo、TGF-β 和 NF-kappa B等信号通路来发挥治疗房颤的作用。研究结论:本研究初步探索和预测了黄连治疗房颤的药效物质基础与分子生物学机制,并在后续实验中验证盐酸小檗碱是否可能通过TGF-β信号通路发挥抗房颤的作用。临床应用主要为小檗碱的盐酸盐和硫酸盐,两者药理作用相似,而硫酸小檗碱为兽用非处方药,故选取盐酸小檗碱进一步实验。第三部分:基于Galectin-3介导的TGF-β1/Smad3通路探讨参连复脉颗粒有效成分小檗碱抗炎抗心房早期纤维化的机制研究方法:实验一:参连复脉颗粒有效成分小檗碱对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞炎症反应的影响建立LPS诱导的RAW264.7炎症反应模型,分为正常对照组、模型组、盐酸小檗碱0.1 μM组、盐酸小檗碱1 μM组、盐酸小檗碱10μM组、阳性药组,采用MTT法检测RAW264.7细胞活性及增殖,荧光染色双标法观察RAW264.7极化,ELISA法检测上清液中相关因子水平,Western Blot法检测通路相关蛋白的表达。实验二:参连复脉颗粒有效成分小檗碱对小鼠心肌成纤维细胞纤维化相关蛋白的影响建立LPS诱导的RAW264.7炎症反应培养液+MCFs共培养模型,分为正常对照组、模型组、盐酸小檗碱0.1 μM组、盐酸小檗碱1 μM组、盐酸小檗碱10 μM组、阳性药组、AC-SDKP组,Western Blot法检测通路相关蛋白的表达。研究结果:实验一:细胞活性及增殖情况:与正常对照组比较,模型组OD值显著升高(P<0.01),提示LPS可促进RAW264.7细胞增殖;与模型组比较,0.1 μM、1 μM、10 μM盐酸小檗碱组和阳性药组OD值显著降低(P<0.01);与阳性药组比较,1 0 μM盐酸小檗碱组OD值显著降低(P<0.01),0.1 μM、1μM盐酸小檗碱组OD值无统计学差异(P>0.05);与0.1 μM盐酸小檗碱组比较,10 μM组OD值显著降低(P<0.01),1 μM组OD值无统计学差异(P>0.05)。RAW264.7极化:与正常对照组比较,模型组CD163(+)/CD68(+)显著降低(P<0.01);与模型组比较,0.1 μM盐酸小檗碱组和阳性药组显著升高(P<0.01);与阳性药组比较,0.1 μM盐酸小檗碱组无统计学差异(P>0.05)。CD68荧光强度:各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。CD163荧光强度:各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。上清液炎症因子水平:Galectin-3水平:与正常对照组比较,模型组OD值显著升高(P<0.01);与模型组比较,10μM盐酸小檗碱组和阳性药组OD值显著升高(P<0.01),0.1μM、1 μM盐酸小檗碱组OD值无统计学差异(P>0.05);与阳性药组比较,10μM盐酸小檗碱组OD值显著升高(P<0.01),0.1 μM、1 μM盐酸小檗碱组OD值显著降低(P<0.01);与0.1μM盐酸小檗碱组比较,10 μM组OD值显著升高(P<0.01),1μM组OD值无统计学差异(P>0.05)。IL-6水平:与正常对照组比较,模型组IL-6水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,1 μM、1 0 μM盐酸小檗碱组IL-6水平显著降低(P<0.01),0.1 μM盐酸小檗碱组和阳性药组IL-6水平无统计学差异(P>0.05)。TNF-α水平:与正常对照组比较,模型组TNF-α水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,0.1 μM盐酸小檗碱组TNF-α水平显著降低(P<0.01),1μM、10μM盐酸小檗碱组和阳性药组TNF-α水平无统计学差异(P>0.05)。炎症因子蛋白表达水平:Galectin-3蛋白表达水平:各组间结果比较均无统计学差异(P>0.05)。IL-6蛋白表达水平:与正常对照组比较,模型组IL-6蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,各组IL-6蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。INOS蛋白表达水平:与正常对照组比较,模型组INOS蛋白表达水平增加(P<0.05);与模型组比较,10 μM盐酸小檗碱组INOS蛋白表达水平降低(P<0.05),0.1 μM盐酸小檗碱组INOS蛋白表达水平呈下降趋势(P=0.09),1μM盐酸小檗碱组和阳性药组无统计学差异(P>0.05)。TNF-α蛋白表达水平:与正常对照组比较,模型组TNF-α蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,0.1μM、10 μM盐酸小檗碱组TNF-α蛋白表达水平明显降低(P<0.01),1 μM盐酸小檗碱组和阳性药组无统计学差异(P>0.05)。实验二:Galectin-3、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP-3、TIMP-3 蛋白表达水平:各蛋白表达水平组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。研究结论:盐酸小檗碱可促进LPS诱导的RAW264.7细胞向M2型极化,抑制LPS诱导的炎症反应,但是否基于Galectin-3介导的TGF-β1/Smad3信号通路起到抗早期纤维化的作用有待于进一步研究。