论文部分内容阅读
目的:枳实是“麸炒入药”的代表药味,临床多用于治疗功能性消化不良（Functional dyspepsia,FD）等消化系统疾病,其生用刺激性较强,麸炒后可缓和燥性,提高疗效,本课题以柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷为评价指标,研究麸炒对枳实主要成分的影响;以FD大鼠为模型,研究麸炒前后枳实对于FD模型大鼠胃肠道激素,胃组织内质网应激相关因子,盲肠组织肠道菌群多样性的影响,以期初步阐明枳实治疗FD的作用机制,为麸炒类中药研究提供一定的参考和借鉴。方法:1.参照《中国药典》2015版制备枳实麸品,采用HPLC法检测柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等总黄酮类成分麸炒前后含量变化。2.SPF级SD大鼠60只随机分为空白组、模型组、阳性组、枳实生品组、枳实麸品组,除空白组外,其余组采用“郭海军夹尾法”加以改进连续刺激21 d建立FD大鼠模型,通过一般状态、体重、小肠推进率、胃排空率及HE染色验证造模成功与否。造模结束后分别按空白组、模型组(氯化钠注射液10 m L·kg-1·d-1),阳性组(多潘立酮溶液2.7 mg·kg-1·d-1),枳实生品组(枳实生品溶液9 g·kg-1·d-1),枳实麸品组(枳实麸品溶液9 g·kg-1·d-1)灌胃给药14 d,ELISA法检测血清胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、生长抑素（SS）的含量。3.采用ELISA、RT-PCR、WB法检测大鼠胃组织葡萄糖调节蛋白（GRP78）、肌醇需求酶1（IRE1）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等内质网应激相关因子的表达,采用WB法检测胃组织中凋亡因子Bcl-2、Bax蛋白变化,探究枳实麸炒前后对FD大鼠的治疗作用是否与胃组织内质网应激有关。4.通过16S r DNA扩增子测序技术对大鼠盲肠粪便菌群进行测序,分别进行Alpha多样性、Beta多样性、不同分类水平下菌群的相对丰度及差异物种分析,探究FD大鼠肠道菌群结构变化以及枳实对FD大鼠肠道菌群结构的调节作用。结果:1.参照《中国药典》2015版一部,以麦麸:枳实投料比为10:1,中火炒至枳实表面色变深,筛去麦麸,放凉,得枳实麸品。确定含量测定的最佳色谱条件为:色谱柱:Alltima TMC18柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相:乙腈-0.1%甲酸（20:80）;流速:1.0 m L/min;检测波长:284 nm;进样量:10μL;柱温:30℃,且麸炒后柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷等黄酮类成分含量均有所降低。2.连续造模21 d后,大鼠精神状态差,活跃度低,毛色枯黄脱落,体重、肠推进率及胃排空率明显降低（P<0.01）,HE染色发现模型组大鼠胃组织无明显病理学变化,表明FD大鼠模型建立成功。给药14 d后,与模型组相比,阳性组、麸品组大鼠体重明显增加（P<0.01）,GAS、MTL含量明显增加（P<0.01）,SS含量明显降低（P<0.01）。与模型组相比,生品组大鼠体重增加（P<0.05）,GAS、MTL分泌增加（P<0.05）,SS分泌降低（P<0.05）。表明枳实麸品可更好改善FD大鼠胃肠动力,增加胃肠激素分泌,进而改善FD大鼠一般状态。3.与空白组相比,模型组大鼠胃组织中IRE1、GRP78等内质网应激相关因子的m RNA及蛋白表达明显增加（P<0.05）,JNK在m RNA水平上表达显著增加（P<0.05）,与模型组相比,阳性组、麸品组大鼠胃组织中IRE1、GRP78m RNA及蛋白表达显著降低,JNK m RNA表达降低。与空白组相比,模型组大鼠胃组织Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加（P<0.05）,与模型组相比,阳性组、麸品组大鼠胃组织Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达降低（P<0.05）。4.采用16S r DNA扩增子测序技术对大鼠肠道菌群进行分析,结果发现,FD模型大鼠肠道菌群多样性及丰度下降,在门水平上,与空白组相比,厚壁菌门相对丰度降低,拟杆菌门、变形菌门相对丰度增加,结合LEfse分析结果及相关文献推测毛螺菌科、瘤球菌科、普雷沃氏菌科丰度变化可能与FD的发生密切相关,给药治疗后可调整菌群结构,且枳实麸品的作用优于生品。结论:枳实麸炒后以柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷为代表的黄酮类成分显著降低。药效学考察发现,枳实生品及麸品可增加FD大鼠胃排空率及小肠推进率,调整胃肠道激素分泌,改善一般状态,其作用机制可能与抑制胃组织IRE1、GRP78、JNK等内质网应激相关因子表达,减缓内质网应激现象,降低凋亡蛋白表达从而增强胃动力有关,且麸炒后效果更佳。肠道菌群中毛螺菌科、瘤球菌科、普雷沃氏菌科相对丰度的变化可能与FD有关,枳实麸品对FD大鼠肠道菌群结构的调节作用优于生品。综上所述,枳实麸炒后其黄酮类成分虽有所降低,但其仍可通过调节胃肠道激素分泌、抑制内质网应激及调节肠道菌群多样性及丰度缓解FD相关症状。