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第一部分:盲肠结扎穿孔诱导脓毒症小鼠模型的建立目的:脓毒症3.0的定义为感染引起宿主免疫反应失调所致的致命性器官功能障碍。尽管盲肠结扎穿孔(CLP)模型是构建脓毒症动物模型的经典方法,但该模型所诱导的感染程度会受到多种实验条件的影响。第一部分实验将就脓毒症模型建立后,对小鼠的生存率、腹部炎症和器官损伤情况进行观察研究和分析,旨在为后续脓毒症免疫调控的研究建立一个合适感染程度的CLP模型。方法:选取6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,在距盲肠终端0.5cm、1cm或1.5cm处结扎,用22G或26G针头贯通穿孔建立腹腔感染模型,不进行盲肠结扎穿孔的假手术组(Sham)作为对照组。CLP组按不同结扎长度和针头大小分为4组,术后连续7天观察各组小鼠生存情况,绘制生存曲线。术后24小时,通过下腔静脉采血测定与器官功能相关的5个血清学指标,对小鼠心脏和肝脏进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)病理染色,观察器官损伤情况。结果:术后7天内Sham组小鼠未出现死亡。穿刺针头较小的CLP 1组小鼠和结扎长度较短的CLP 2组小鼠,其7天生存率均不低于80%,为轻度感染。结扎较长的CLP 4组在4天内全部死亡,生存率显著小于Sham组(P<0.001),为重度感染。结扎长度为1cm、针头为22G的CLP 3组,其7天生存率为36.8%,显著小于Sham组的生存率(P<0.001),为中等程度感染。中度感染的CLP组小鼠,术后早期可见小鼠盲肠坏死,后期可见粘连性肠梗阻、腹腔积液增多、脾肿大,结扎穿孔处被周围组织逐渐包裹形成可导致慢性感染的脓肿。CLP组小鼠外周血中肌酸激酶(Creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)均显著高于Sham组。HE病理切片结果显示CLP组小鼠心肌纤维断裂,肝脏内可见肝细胞肿胀,两者均可见炎症细胞浸润。血清学和组织病理学均证明了小鼠存在多器官损伤,符合脓毒症3.0定义。结论:综上所述,结扎长度为1cm,穿刺针头22G条件下进行的CLP手术,成功为后续开展脓毒症免疫抑制实验的研究构建了合适感染程度的脓毒症模型。第二部分:脓毒症中淋巴细胞凋亡与PD-1的相关性目的:脓毒症患者易患继发感染而死亡,与体内淋巴细胞耗竭导致的脓毒症后期持续的慢性感染和免疫抑制有关。程序性死亡受体PD-1在其中可能起到重要作用。本部分实验将在第一部分成功建立脓毒症模型的基础上,重点探索脾脏内淋巴细胞凋亡情况和PD-1分子表达水平的相关性。方法:本实验采用第一部分选取的实验条件进行盲肠结扎穿孔(CLP)手术,建立脓毒症模型,以Sham组作为对照组。于模型建立后0、1、3、7天取小鼠脾脏,在透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)下观察脾脏内细胞显微结构。采用TUNEL细胞凋亡实验观察脾脏细胞凋亡情况。采用免疫组化方法观察脾脏内PD-1表达情况。制备脾脏单细胞悬液,采用流式细胞术检测CD4+T细胞数量、CD8+T细胞数量和细胞表面PD-1表达水平。结果:CLP术后7天可见脾脏内存在细胞核固缩并聚集在细胞边缘的凋亡淋巴细胞。TUNEL实验结果显示,CLP后脾内凋亡细胞持续增多,在7天时可见显著升高(P=0.044)。免疫组化结果显示CLP术后第1天起,PD-1阳性表达的细胞数明显增加,主要位于富有T淋巴细胞的脾脏动脉周围淋巴鞘(Periarterial lymphatic sheath,PALS)区域。流式细胞检测提示CD4+T淋巴细胞在CLP后第1天至第7天持续显著减少,细胞表面PD-1表达水平自第1天起即显著升高,此后维持在高水平。CD8+T淋巴细胞在CLP后早期略有下降,至第7天显著减少,细胞表面PD-1表达水平在第7天显著上升,与细胞数量存在负相关(r=-0.99,P=0.006)。结论:脓毒症小鼠脾内细胞凋亡逐渐增多,T淋巴细胞数量逐渐减少,细胞表面PD-1表达水平升高,两者存在负相关,高水平PD-1能导致T淋巴细胞数量减少。第三部分:PD-L1介导PMN-MDSC在脓毒症中发挥免疫抑制作用目的:髓系抑制性细胞(MDSCs)是一种能抑制T细胞增殖和功能的未成熟髓系细胞。脓毒症中,MDSCs的长期存在会导致脓毒症患者免疫功能被抑制,易患继发感染。本部分研究旨在观察脓毒症小鼠中MDSCs的分布和数量、MDSCs中PD-L1的表达变化和通过PD-L1发挥作用的MDSCs主要亚群,探讨MDSCs在脓毒症中发挥免疫抑制作用的机制。方法:采用第一部分选取的实验条件进行盲肠结扎穿孔(CLP)手术诱导小鼠脓毒症模型,假手术组(Sham)作为对照组,于术后0、1、3、7天取小鼠骨髓和脾脏。采用流式细胞术检测骨髓和脾脏内MDSCs及其亚群的数量和比例。采用透射电镜观察脾脏内亚细胞结构。采用流式细胞术检测骨髓和脾脏内MDSCs及其亚群上PD-L1表达水平。采用免疫荧光染色和免疫印迹法(Western blot)检测骨髓和脾脏PMN-MDSC上PD-L1的表达。采用体外共培养实验观察骨髓PMN-MDSC对T淋巴细胞的抑制作用。结果:CLP术后早期骨髓MDSCs数量较少,但随后持续增加,至第7天时,增至骨髓细胞的81.45%±2.70%。骨髓内PMN-MDSC是MDSCs中数量占主导的亚群,其变化规律与MDSCs一致;M-MDSC数量较少,在CLP术后持续增加,但Sham组中M-MDSC也增加。透射电镜下可见CLP术后脾脏内出现多形核型和单核型细胞。流式结果显示第7天时脾脏内MDSCs显著增加,主要是由于M-MDSC明显增多。CLP术后1天骨髓和脾脏MDSCs上PD-L1阳性表达比例升高,但随后下降。PMN-MDSC是表达PD-L1的主要亚群,细胞表面PD-L1的表达量高于M-MDSC。骨髓和脾脏Ly6G和PD-L1免疫荧光双染结果显示CLP术后1天,骨髓内Ly6G荧光虽弱,但PD-L1荧光强度高于Sham组,脾脏内PD-L1荧光强度增加,Ly6G和PD-L1双阳性细胞增加。CLP术后1天分离纯化的骨髓和脾脏PMN-MDSC内PD-L1蛋白水平显著升高。骨髓PMN-MDSC与T淋巴细胞共培养后能显著抑制T细胞增殖。结论:PD-L1/PD-1轴可能是脓毒症早期介导骨髓PMN-MDSC发挥免疫抑制作用的途径。