过氧草酸酯类化学发光（Peroxyoxalate Chemiluminescence,PO-CL）作为一种间接的化学发光反应,是典型的基于能量转移的化学发光方法。PO-CL体系由过氧草酸酯?过氧化氢和荧光物质组成。常用的过氧草酸酯类化学发光试剂有双（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（bis（2,4,6-trichlorophenyl）oxalate,TCPO）,双（2,4,5-三氯水杨酸正戊酯）草酸酯（bis（2,4,5-trichloro-6-carbopentoxyphenyl）oxalate,CPPO）,双（2,4,二硝基苯基）草酸酯（bis（2,4-dinitrophenyl）oxalate,DNPO）等。PO-CL体系的反应过程较复杂,目前人们对其发光机理的解释各有不同。其中一种较为公认的发光机理是:过氧草酸酯化合物与过氧化氢反应生成具有高能量的不稳定中间体1,2-二氧乙基二酮（C₂O₄）,此中间体不能发光,但其分解过程中会把释放的能量传递给荧光分子,荧光分子吸收能量后被激发并跃迁至激发态,其返回到基态时会伴随着光发射。与荧光分析法相比,PO-CL反应不受自发荧光或激发光的干扰,具有背景低、灵敏度高的特点。碗烯（Corannulene）是一种碗状多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbon,PAH）,由中心的环戊烷和外周的五个苯环组成。作为一种简单的曲面分子,它具有大偶极矩和电子接受能力等特点。碗烯及其衍生物的制备方法日益成熟,其在荧光、电化学等领域已有初步应用,但其在化学发光分析领域的应用还未见报道。碗烯具有疏水性和荧光特性,与PO-CL体系的兼容性良好。因此,本论文将碗烯引入PO-CL体系,建立了碗烯介导的过氧草酸酯类化学发光反应。此体系的组成为TCPO,过氧化氢（H₂O₂）和碗烯（或其衍生物）。除此之外,我们考察了金属纳米微粒对此体系的影响。基于金纳米微粒对碗烯介导PO-CL反应的淬灭作用,论文建立了半胱氨酸和乙酰胆碱酯酶的化学发光分析方法,论文主要研究内容详述如下:在第二章中,我们首先考察了碗烯介导TCPO-H₂O₂ CL反应的动力学曲线,当无碗烯时,TCPO-H₂O₂反应无CL信号;当加入10^-3 M碗烯时,体系产生强的闪光型CL信号。光谱测定显示TCPO-H₂O₂-碗烯体系的发光符合传统的PO-CL发光机理:体系的H₂O₂氧化TCPO产生具有高能量的活性中间体C₂O₄,其将能量转移给碗烯,生成激发态碗烯,激发态碗烯返回基态时释放能量,产生化学发光信号。我们进一步研究了增强剂对该化学发光体系的影响,对比了Tris,咪唑和柠檬酸钠的信号增强效果。在低浓度范围内,CL信号均随增强剂浓度的增大而增大,超过最佳浓度时信号随浓度增加而降低。柠檬酸钠最佳浓度为0.68 m M,CL信号比无增强剂时提高了20.5倍;Tris最佳浓度为0.63 m M,CL信号比无增强剂时提高了14.3倍;咪唑最佳浓度为1.0 m M,CL信号比无增强剂时提高了10.2倍。因此,将柠檬酸钠作为该体系的增强剂作后续研究。之后,我们考察了具有曲面结构的碗烯及其衍生物和与碗烯具有相似结构的平面荧光分子在TCPO-H₂O₂CL体系中发光能力。所用曲面分子分别为（1）碗烯、（2）1,2,5,6-四苯基碗烯、（3）1,2,5,6-四对甲氧基碗烯、（4）1,2,5,6-四邻氯苯基碗烯、（5）1,2,5,6-四间甲基苯基碗烯、（6）1,2,5,6-四对甲基苯基碗烯、（7）1,2,5,6-四溴碗烯、（8）五对甲基苯基碗烯、（9）单吡啶基碗烯,平面荧光分子为（10）晕苯。我们首先测定了这10种荧光分子的紫外可见吸收光谱、荧光激发谱图和荧光发射谱图。以上各化合物的荧光发射波长分别为434、442、460、438、448、450、无、452、436、450 nm。碗烯分子的共轭体系变大将导致其荧光发射波长红移。当浓度为1×10^-5 M时,我们将碗烯产生的荧光信号设定为1,这十种化合物产生的荧光信号强度由弱至强排序为:（7）（0）<（1）（1）<（9）（2.0）<（10）（3.0）<（4）（4.6）<（2）（5.2）<（5）（5.6）<（6）（5.7）<（8）（6.2）<（3）（7.7）。之后,我们考察了这10种荧光物质在TCPO-H₂O₂体系中的CL信号。当浓度为5×10^-5 M时,我们将碗烯产生的CL信号设定为1,这十种化合物产生化学发光信号强度由弱至强排序为:（7）（0.16）<（9）（0.72）<（4）（0.78）<（1）（1）<（10）（4.0）<（2）（5.1）<（5）（8.1）<（6）（10.0）<（8）（20.9）<（3）（43.8）。以上实验结果表明,化学发光信号强度与其荧光性能有关联。在曲面分子中,碗烯介导CL体系的信号强度低于晕苯,但是通过改变取代基的种类和取代基的位置,可以大幅度提高CL信号的强度。在这十种荧光分子中,化合物（3）1,2,5,6-四对甲氧基苯基碗烯表现出优异的化学发光性能,其荧光信号强度为碗烯的7.7倍,但在PO-CL体系中产生的CL信号为碗烯的43.8倍。1,2,5,6-四对甲氧基苯基碗烯在PO-CL中良好的化学发光响应,为开发新型的CL体系奠定了基础。1,2,5,6-四对甲氧基苯基碗烯具有良好的PO-CL响应信号,但由于样品量不足,课题未对1,2,5,6-四对甲氧基苯基碗烯进行研究,而是以样品量充足的碗烯作为曲面荧光分子的代表进行了后续的研究。在过氧草酸酯化学发光领域,崔华课题组首次报道了金纳米粒子（Gold Nanoparticles,Au NPs）在TCPO-H₂O₂ CL反应中的发光性质。粒径在2.6-6.0 nm范围时,Au NPs在体系中产生化学发光信号,他们认为激发态Au NPs的生成是产生化学发光的原因。当粒径大于6.0 nm时,由于Au NPs的表面等离子体共振现象导致没有化学发光产生。受此启发,论文第三章考察了Au NPs对碗烯介导TCPO-H₂O₂CL反应的影响。我们采用柠檬酸钠法制备了Au NPs,其粒径为15.7±3.5 nm。在预实验中,我们直接将制备的Au NPs加入TCPO-H₂O₂-碗烯体系,其CL信号增强了4.3倍。柠檬酸钠是制备Au NPs的稳定剂和还原剂,但同时它也是TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应的增强剂。那么,增强的CL是来自于Au NPs,还是来自于柠檬酸钠呢?为了探索Au NPs的CL增强机理,我们对金溶胶进行了离心、分离和水重悬,并进行了以下实验。分别以水和以金溶胶中相同浓度的柠檬酸钠为对照,考察了水重悬Au NPs和常规Au NPs对TCPO-H₂O₂-碗烯反应CL信号的影响。结果表明金溶胶的增强作用来自于其溶液中含有的柠檬酸钠,而Au NPs则对TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应显示显著的淬灭作用。当Au NPs浓度为1.90×10^-10 M时,TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应信号的80%被淬灭。之后,我们考察了实验条件对金纳米微粒淬灭效率的影响,最终实验条件为:乙腈作溶剂,TCPO浓度为1×10^-3 M,碗烯浓度为6.25×10^-5M,过氧化氢浓度为0.5 M。然后,我们制备了3种粒径的金纳米粒子,其粒径分别为6.6±1.1,15.7±3.5和26.0±7.7 nm,其浓度分别为2.76×10^-7,1.90×10^-9和5.75×10^-10 M。在最优的实验条件下,我们采用浓度为0.2 mg m L^-1柠檬酸钠为增强剂,考察了金纳米微粒的粒径对TCPO-H₂O₂-碗烯化学发光体系淬灭效率的影响。结果显示,6.6 nm Au NPs的抑制效率是34%,15.7 nm Au NPs的抑制效率是80%,26 nm Au NPs的抑制效率是82%。我们也研究了Au NPs对TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应的淬灭机理。最初我们认为Au NPs的淬灭作用可能与化学发光共振能量转移（Chemiluminescence Resonance Energy Transfer,CRET）有关。化学发光发射光谱与受体吸收光谱的重叠范围是影响CRET的一个重要因素。我们发现碗烯介导的TCPO-H₂O₂CL反应最大发射波长位于425 nm处,而Au NPs的共振吸收峰位于520 nm附近,与CL反应的光谱重叠较差。众所周知,银纳米粒子的共振吸收波长位于420 nm附近。与金纳米微粒相比,银纳米粒子共振吸收光谱与TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应的光谱重叠性良好。但令人吃惊的是,银纳米粒子对该体系没有淬灭作用。以上结果表明金纳米粒子的抑制作用不能归因于CRET。根据文献报道,活性中间体C₂O₄的生成是PO-CL反应的关键。因此,我们分别考察了发光试剂TCPO与金纳米粒子和银纳米粒子的相互作用。我们测定了TCPO与这两种纳米粒子作用前后的紫外吸收光谱,结果表明TCPO的紫外吸收峰在与金纳米粒子孵育后下降了50%,而与银纳米粒子孵育后几乎保持不变。此结果提示我们TCPO与金纳米粒子的作用强,能吸附于其表面,而与银纳米粒子之间的相互作用微弱。除此之外,我们还考察了这两种纳米粒子对碗烯荧光的影响,结果表明1.9×10^-9 M金纳米粒子能使碗烯荧光降低37%,而银纳米粒子对碗烯荧光几乎没有影响。基于以上实验结果,我们推测化学发光试剂TCPO与Au NPs表面之间的相互作用对于淬灭过程起到了关键作用。我们猜想有以下两个原因。首先,吸附于Au NPs表面的TCPO可能难于被H₂O₂氧化,导致形成的活性中间体C₂O₄的减少和被激发碗烯量的下降。其次,Au NPs对碗烯荧光的淬灭作用,进一步影响了其CL信号强度。机理研究表明化学发光试剂TCPO与Au NPs表面之间的相互作用对于淬灭过程起到了关键作用。那么当Au NPs发生聚集时,其比表面积将显著减小,对TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应的淬灭作用将消失。也就是说,分散状态良好的Au NPs对TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应具有良好的淬灭作用,而聚集的Au NPs则对此体系无淬灭作用。我们对此猜测进行了验证,当Au NPs浓度为4.75×10^-10M时,对PO-CL体系的信号淬灭率为54%,而聚集后的淬灭率为15%。基于不同聚集状态Au NPs对TCPO-H₂O₂-碗烯CL体系具有不同的淬灭效率,论文第四章提出了CL法检测半胱氨酸（Cysteine,Cys）。当溶液中存在半胱氨酸时,半胱氨酸的巯基可与Au NPs形成Au-S键,溶液中大量存在的带有半胱氨酸的Au NPs在天冬氨酸的作用下相互交联在一起,导致金纳米粒子的聚集,淬灭作用消失。当溶液中无半胱氨酸时,Au NPs的保持良好的分散状态,对TCPO-H₂O₂-碗烯CL体系具有良好的淬灭作用,产生低的CL信号。根据CL信号的恢复程度,可实现半胱氨酸的定量。我们优化了该体系的实验条件,选定的实验条件为:柠檬酸钠浓度为0.43 mg m L^-1,天冬氨酸浓度为11.36 mΜ,金纳米粒子浓度为3.27×10^-11M。在优化的实验条件下,测定半胱氨酸的线性范围为0.075-0.75μM,检测限为0.064μM,重现性良好（RSD为2.52%）,且具有较好的选择性和特异性。除此之外,我们还将基于Au NPs的TCPO-H₂O₂-碗烯CL体系应用于了乙酰胆碱酯酶的活性测定及其抑制剂筛选。检测原理:乙酰胆碱酯酶可催化底物硫代乙酰胆碱水解产生巯基胆碱。巯基胆碱中含有巯基和季铵盐基团,其巯基可与Au NPs形成金-硫键,季铵盐基团可通过静电作用与带负电荷的Au NPs结合。因此,巯基胆碱可引发Au NPs的聚集,使TCPO-H₂O₂-碗烯CL体系的信号恢复,通过测定CL信号的恢复程度,可实现乙酰胆碱酯酶的活性测定。在优化的实验条件下,测定乙酰胆碱酯酶活性的线性范围为1-15 m U m L^-1,检测限为0.67 m U m L^-1。之后,我们以溴新斯的明和他克林这两种药物为模型药物,验证了所建立方法用于乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选的可行性。随着抑制剂浓度的升高,水解得到巯基胆碱的量逐渐降低,导致CL信号强度降低。结果表明,化学发光信号随溴新斯的明和他克林浓度对数值变化的线性范围分别为0-750 n M和0-1000 n M,两种抑制剂的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为69.04 n M和125.36 n M。从分析化学的角度来看,Au NPs淬灭的TCPO-H₂O₂-碗烯CL反应是一种通用的传感策略,可用于检测各种可能影响Au NPs分散状态的分析物。因此,该方法在生物化学、环境分析、药物分析?临床诊断等各个领域都有应用的潜力。