论文部分内容阅读
目的:黑素细胞功能丧失导致白癜风的发生,白癜风严重影响人的身心健康。目前缺少一种创伤小,维持久且效果好的应对白癜风的治疗方法,而利用再生医学技术直接重编程得到黑素细胞似乎可以为白癜风的治疗提供新的思路。如果能将原本无色素的皮肤细胞直接重编程为具有功能性的黑素细胞,势必能有助于改善白癜风患者的困境。虽然目前直接重编程方法很热门,但对于黑素细胞的直接重编程的方法没有定论,可供选择的转录因子众多,令人眼花缭乱。我们需要构建一种简便并且高效率的直接重编程黑素细胞的方法;对转录因子进行筛选以最优转录因子组合进行黑素细胞直接重编程,增加重编程的效率和安全性;并且验证直接重编程得到的诱导黑素细胞（iMels）的体外和体内功能性,证明其可应用于临床的可能性。方法:首先建立一套简便易重复的浓缩慢病毒包装系统用以递送相应转录因子,利用流式细胞术检测病毒滴度,通过观察感染细胞荧光率、流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链式反应分析（q RT-PCR）分别确定最佳感染方法,感染时间和感染病毒复数（MOI）;接着在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中导入6个转录因子（Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9和Snai2）以进行向黑素细胞的直接重编程,并通过观察形态学改变和q RT-PCR检测转录因子基因和黑素相关基因表达水平变化来初步验证多因子直接重编程iMels特征;直接重编程体系的升级优化从以下几个方面进行:1)增加细胞增殖性:排列组合添加小分子胰岛素,皮质类固醇和腺苷,通过细胞计数试剂盒（CCK8）检测细胞增殖性、q RT-PCR检测转录因子基因和黑素特征性基因的表达水平;2)提高感染细胞纯度:添加嘌呤霉素筛选细胞,用流式细胞术检测绿色荧光蛋白阳性（GFP+）率;3)改善细胞贴附基质:比较使用不同基质胶Gelatin和Fibronectin的结果,通过q RT-PCR检测转录因子基因和黑素特征性基因的表达水平;4)激活黑素发育通路:添加Wnt通路激活剂Chir99021,通过q RT-PCR检测转录因子基因和黑素特征性基因的表达水平;对于转录因子的筛选,先在MEFs中导入相应的5个转录因子（随机去除6个转录因子中的1个）,通过q RT-PCR检测各组中黑素特征性基因来发现重要转录因子,再将重要的转录因子进行不同的排列组合用来感染MEFs,通过q RT-PCR检测各组中黑素特征性基因以发现最有效的转录因子组合,并通过流式细胞术检测重编程效率;最后对用优化的直接重编程体系和最佳转录因子组合生成iMels进行鉴定,体外表型和功能性鉴定包括形态学观察、β半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,q RT-PCR检测转录因子基因和黑素特征性基因、免疫荧光检测黑素特异性蛋白、Masson-Fontana染色和L-DOPA染色检测黑色素分泌;在体内鉴定中,分别利用皮内注射法和小室法进行毛囊重构以移植iMels,通过免疫荧光检测黑素特异性蛋白、Masson-Fontana染色和LDOPA染色检测黑色素分泌以证明iMels的体内功能性。结果:（1）利用转录因子Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9和Snai2进行向黑素细胞的直接重编程,可得到形态类似于黑素细胞的iMels,但黑素特征性基因表达量虽在直接重编程前7天不断上调,但随后表达量不断下调;（2）在优化直接重编程体系中,CCK8检测发现同时添加氢化可的松,胰岛素和腺苷显著提升直接重编程细胞的增殖力,并且显著上调黑素特征性基因（Tyrp1和S100）表达量;经过嘌呤霉素筛选后的转化细胞纯度可达95%以上;使用Gelatin组的黑素特征性基因表达量高于使用Fibronectin组;Wnt通路激活剂（小分子Chir99021）在向黑素细胞的直接重编程过程中上调转录因子Mitf和Sox10表达量,并上调iMels的黑素特征性基因表达量;（3）在对转录因子的筛选中,去除Sox10、Mitf和Pax3这三个转录因子后转化细胞的黑素特征性基因表达基本沉默,利用两因子Sox10和Mitf得到的iMels（2F iMels）的黑素特征性基因表达量最高,重编程效率达到43%左右;（4）在鉴定2F iMels中,细胞衰老β-半乳糖苷酶染色证明培养到20天以后的细胞会发生成熟老化,黑素特征性基因表达量接近于真正的黑素细胞,黑素特征性标志物TYRP1和DCT表达阳性,黑素特异性Masson-Fontana染色和L-DOPA染色也均呈阳性;（5）2F iMels移植的部位黑素特征性标志物TYRP1和DCT免疫染色,黑素特异性Masson-Fontana染色和L-DOPA染色均呈阳性。结论:利用转录因子Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9和Snai2直接重编程得到的iMels增殖性差并且黑素特征基因表达和真正的黑素细胞相比差距较大,前期的向黑素细胞直接重编程体系需要被优化;在优化直接重编程体系中:1)添加氢化可的松,胰岛素和腺苷的优化诱导培养基可以改善直接重编程细胞的增殖力,并且对于黑素特征性基因的表达也有一定促进作用;2)在基质胶方面,Gelatin比Fibronectin更适用于黑素转分化;3)Wnt通路激活剂可促进向黑素细胞的直接重编程;在筛选转录因子中,仅利用Sox10和Mitf就可以进行向黑素细胞的直接重编程,成功得到2F iMels;在功能表征方面,2F iMels会发生成熟老化,不具有致瘤性,并且2F iMels在体外和体内都具有功能性。