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目的:皮肤是人类机体中与外部环境接触最多的器官,其完整性的改变以及与诸多环境因素的相互作用都会直接影响到生物体的健康。皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)是第二常见的皮肤恶性肿瘤,属于侵袭性癌,有非常强的恶性趋势,较其他类型的皮肤癌增殖较快,有一定的耐药性,转移率较高,易向淋巴结、肝脏、肺等转移,甚至危及生命。皮肤癌的病因十分复杂,既涉及到如紫外线照射、化学致癌物质、电离辐射及病毒等环境致癌因素,又与机体细胞的DNA改变、遗传特性、免疫功能及激素水平的变化等密切相关。表观遗传修饰在皮肤癌的发病机制中也起到重要作用。近年来RNA甲基化介导的转录后调控作用已成为表观遗传学新研究领域。N6-甲基化腺嘌呤(N6-methyl-adenosine,m6A)是RNA表观遗传的标志之一,研究转录过程对真核基因表达的调控。RNA甲基化修饰在体内受到3种修饰蛋白的调控,分别是编码器(writer)、消码器(eraser)和读码器(reader)。读码器即为m6A结合蛋白,目前被报道的特异性识别和结合m~6A的蛋白,主要是YTH-结构域家族成员,主要包括YTHDF1、YTHDF2,、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2等,其中YTHDF1会通过与翻译元件的相互作用,提高翻译效率,积极促进蛋白质合成。白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)是趋化因子家族的一种细胞因子,又称趋化因子CXCL8,由巨噬细胞和上皮细胞分泌的一种炎性趋化性因子。IL-8主要生物活性是吸引和激活中性粒细胞,中性粒细胞在与其接触后会发生形态学变化,这些效应导致机体局部的炎症反应。有研究显示IL-8在黑色素瘤中与其同源受体CXCR1和CXCR2显示着过度表达。且IL-8可通过与相应受体结合后调节细胞的增殖、凋亡、迁移等。因此,本研究旨在观察正常皮肤细胞与鳞状皮肤癌细胞中YTHDF1的含量变化,明确YTHDF1在鳞状皮肤癌生长过程中的作用,同时分析YTHDF1低表达后对鳞状皮肤癌细胞增殖,迁移,耐药,凋亡的影响及对IL-8在鳞状皮肤癌中的调控作用,为深入研究YTHDF1对细胞的调控作用提供理论和实验依据,并为通过甲基化的思路来防治皮肤癌提供新的思路和靶点。研究方法:选用人鳞状皮肤癌细胞A431细胞,建立YTHDF1低表达的细胞稳态模型后,得到A431 sh-GFP,A431 sh-YTHDF1两种细胞,按照要求严格以10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素的完全培养基,5%CO2的恒温细胞培养箱孵育进行细胞培育及传代。将细胞分为A431 sh-GFP和A431 sh-YTHDF1两组进行一系列的细胞功能检测,包括细胞增殖、迁移、耐药、凋亡等。首先通过Western blot免疫印迹方法检测两种细胞的YTHDF1蛋白表达含量,再通过CCK8检测细胞增殖情况,将A431sh-GFP;A431 sh-YTHDF1两种细胞接种于96孔板上,24h后加入CCK8试剂,1h后在酶标仪450nm处测得吸光度,获得增殖数据;按照凋亡试剂盒说明对两组细胞进行凋亡检测的准备工作,之后立即在流式细胞仪上进行检测;在细胞培养24h之后加入化疗药五氟尿嘧啶(浓度分别为1μM,2μM,4μM,8μM)和顺铂(浓度分别为5μM,10μM,20μM,40μM),1h后在酶标仪450nm处测得吸光度,分析数据得到两组细胞耐药情况;之后进行细胞划痕迁移实验,将两组细胞按照5×105/孔密度接种到六孔板中,隔天用枪头垂直于背面画好的横线划痕,再次放入培养箱,到一定时间进行拍照,通过视野照片计算出划痕率及细胞迁移率;通过ELISA实验检测两组细胞上清液中IL-8的含量;通过总RNA的提取和Real-time PCR检测两组细胞中IL-8 mRNA的表达含量,同时也检测加入放线菌素D处理后的0h,3h,6h三个时间点的两组细胞稳定性的改变;在两组细胞中分别加入等量的1μg/ml的IL-8重组体蛋白进行恢复实验,此时得到四组细胞(A431 sh-GFP、A431sh-YTHDF1、A431 sh-GFP+IL-8、A431 sh-YTHDF1+IL-8)对该四组细胞重复之前的一系列细胞功能检测,根据恢复实验结果分析IL-8因子在鳞状皮肤癌发生中的作用。结果:1.研究结果显示用紫外线B(Ultraviolet radiation b,UVB)和砷(arsenic,As)处理过的HaCaT细胞,可使其YTHDF1的蛋白表达水平增加。比较两种正常的皮肤细胞(HaCaT细胞与NHEK细胞)与发生鳞状皮肤癌变的细胞(A431细胞与PAM212细胞)中YTHDF1的蛋白表达,发现在鳞状皮肤癌细胞中的YTHDF1含量明显增多。2.与对照组A431 sh-GFP相比,24h增殖实验结果显示低表达了YTHDF1后增殖能力减弱(P<0.01);凋亡流式检测结果显示A431 sh-YTHDF1组24h之内的凋亡率高于没低表达的A431 sh-GFP组(P<0.01);划痕实验显示,低表达YTHDF1后细胞的迁移能力及划痕愈合能力均减弱(P<0.01);耐药实验中,通过CCK8和流式凋亡两种方法共同检测发现,两组细胞的数量均随着给药浓度的增加而逐渐减少且A431 sh-GFP组的敏感性高于A431 sh-YTHDF1(P<0.05)。3.经过对A431细胞下游影响因子的测序,得出相应的测序图及火山分布图,两组图均显示在众多的影响因子中,IL-8因子在鳞状皮肤癌的发生中起到的影响作用相较于其他因子差异更大一些。ELISA试剂盒检测两种A431细胞上清液中IL-8炎性因子的表达含量发现,未低表达YTHDF1组的IL-8表达含量高于低表达组的表达含量(P<0.01);同时经RT-PCR检测IL-8的mRNA表达水平发现A431 sh-GFP组的IL-8 mRNA表达水平始终高于A431 sh-YTHDF1组(P<0.05);放线菌素D的稳定性检测也显示A431 sh-GFP组的IL-8 mRNA表达水平始终高于A431sh-YTHDF1组,且随着放线菌素D处理时间的增长,两组间IL-8的稳定性均有所下降。4.细胞恢复实验检测四种不同的细胞功能。检测结果发现,在四组细胞(A431 sh-GFP、A431 sh-YTHDF1、A431 sh-GFP+IL-8、A431 sh-YTHDF1+IL-8)中,当YTHDF1与IL-8同时存在时(A431 sh-GFP+IL-8组),增殖能力较其他三组最强,迁移速度和划痕修复率较其他三组最高,对化疗药物的敏感性也同样为四组中表达能力最强的,凋亡程度为四组细胞最低。相反地,当YTHDF1与IL-8两者均不存在时(A431 sh-YTHDF1组),上述四种功能除凋亡外的表达能力显示为四组最弱,凋亡程度为最高,且与其他三组的差异具有一定的统计学意义。同时发现加入IL-8重组体蛋白后相对于之前的A431 sh-GFP和A431 sh-YTHDF1两组细胞其相应的迁移,增殖,耐药有所回升,凋亡有所回降,且均具有一定的统计学意义。结论:1.UVB和砷暴露会导致皮肤细胞中YTHDF1含量上升。2.YTHDF1在鳞状皮肤癌肿瘤细胞中发挥着促进其增殖,迁移,耐药的能力。3.YTHDF1可通过调控IL-8促进鳞状皮肤癌细胞的生长功能。