【摘 要】
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几丁质酶(Chitinase, EC 3.2.1.14)能够分解几丁质,而几丁质是世界上储量占第二位天然资源,因此几丁质酶对工农业生产、自然资源的利用、生物防治、环境保护、医药卫生等都具
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几丁质酶(Chitinase, EC 3.2.1.14)能够分解几丁质,而几丁质是世界上储量占第二位天然资源,因此几丁质酶对工农业生产、自然资源的利用、生物防治、环境保护、医药卫生等都具有重要的社会效益和经济价值。研究土壤微生物产几丁质酶对开发新的几丁质酶资源具有重要意义。本实验用几丁质分离培养基从土壤中筛选到了一些能降解几丁质的细菌和真菌,通过透明圈法和Schales法再从中选出酶活力较高的细菌和真菌各一株,其酶活力达到了1.228 U和0.192 U,分别编号为JX-X-7和JX-Z-7。对这两株菌进行了生长曲线的测定和菌属的初步鉴定,利用单因素优化法对发酵条件和反应条件进行优化提高他们的几丁质酶活力,最后纯化所产的几丁质酶并测定了分子量。经初步鉴定,JX-X-7为葡萄球菌属(Staphylococcus Rosenbach),JX-Z-7为曲霉属(Aspergillus),通过生长曲线测定确定了JX-X-7和JX-Z-7种子液的培养时间分别是6~8 h和24~28 h。通过单因素优化法对JX-X-7和JX-Z-7发酵条件和酶反应条件进行优化,最后确定其产几丁质酶的条件和酶反应条件如下:JX-X-7在pH为8.0的发酵培养基中35℃培养6.5 d,在30℃、pH7.0环境下反应2 min;JX-Z-7在pH为6.5的发酵培养基中35℃培养5 d,在40℃和pH6.5环境下反应2 min。经过优化单位酶活JX-X-7从开始的0.192 U最高达到了3 U提高了15.6倍,而JX-Z-7则从1.228 U最高达到了39.1875 U提高了32倍。本实验对几丁质酶的纯化采用的方法是(NHB4B)B2BSOB4B沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤层析。JX-X-7采用70%、JX-Z-7用90%饱和度一次性沉淀收集后进行透析脱盐、浓缩上样,经Sephadex G-100凝胶过滤层析,在SDS-PAGE上得到了单一条带,JX-X-7产的几丁质酶纯化倍数达到了1.351、回收率为29.71%、分子量为25.0 kDa,JX-Z-7产的几丁质酶其纯化倍数达到了6.484、回收率为42.97%、分子量为28.0 kDa。
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