【摘 要】
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背景蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage,SAH）是一种病死率和致残率极高的疾病。研究认为,早期脑损伤（Early Brain Injury,EBI）引发线粒体的功能障碍,可造成神经功能的损害。P38/MAPK通路是SAH后早期参与调控的重要途径,应用P38抑制可有效改善线粒体功能障碍。而在蛋白组学层面上,线粒体蛋白在SAH中的变化却少有研究。目的探讨SAH的早期阶段,P
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背景蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage,SAH）是一种病死率和致残率极高的疾病。研究认为,早期脑损伤（Early Brain Injury,EBI）引发线粒体的功能障碍,可造成神经功能的损害。P38/MAPK通路是SAH后早期参与调控的重要途径,应用P38抑制可有效改善线粒体功能障碍。而在蛋白组学层面上,线粒体蛋白在SAH中的变化却少有研究。目的探讨SAH的早期阶段,P38抑制剂对神经细胞线粒体差异蛋白基因表达的影响,为SAH的分子机制研究提供理论基础。方法利用氧合血红蛋白（Oxy Hb）诱导Neuro-2a细胞（mouse neuroblastoma N2a cells,小鼠来源神经瘤母细胞,购买自中国科学院上海细胞库）,模拟蛛网膜下腔出血后,氧合血红蛋白对于神经细胞的刺激状态,建立体外SAH模型,设立对照组（Con）、蛛网膜下腔出血组（SAH）及P38抑制剂治疗组（P38+SAH组）,P38抑制剂的终浓度为0.02mmol/L,在细胞完成贴壁后,加入Oxy Hb,使其终浓度为0.01mmol/L,以Oxy Hb作用48h作为观察时间点。1.通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）为基础的非标记定量蛋白质组学分析3组线粒体蛋白的表达,应用DAVID在线工具（Annotation,Visualization,Integrated Discovery数据库）对于差异表达的线粒体蛋白进行基因本体论（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路的富集分析;应用Me V（Multiple Experiment Viewer）软件进行分层聚类热图分析;用STRING在线工具构建出PPI网络,以此来发现差异蛋白及信号通路的表达。2.Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II、和p62的表达,观察P38抑制剂对SAH后自噬的影响。3.通过Western blot和RT-q PCR验证筛选出的差异蛋白Rab7a的表达。结果1.3组中共筛出239个差异蛋白,上调差异蛋白105个,下调差异蛋白134个（符合差异倍数（FC）>1.5or<0.667,P<0.05）。GO富集分析表明:差异蛋白富集在调节MAPK的级联正调控、内吞作用、凋亡过程负调控等细胞生物学功能。在KEGG中:差异蛋白主要在P53信号通路、PI3K-AKT信号通路、轴突导向信号等通路富集。通过PPI分析:以Rab7a、Cox5a、Cacybp等蛋白为核心的9个蛋白互作网络。2.P38抑制剂可调节SAH后神经细胞的异常自噬:与Con组相比,SAH后Beclin-1、P62、LC3-Ⅱ表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与SAH组相比,P38+SAH组的Beclin-1、P62、LC3-Ⅱ表达均有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,表明通过P38抑制剂的应用逆转了异常自噬地发生。3.对于Rab7a线粒体蛋白及m RNA表达的验证:与CON组比较,SAH组Rab7a的表达下降（P<0.05）;与SAH组比较,P38+SAH组中Rab7a的表达上升（P<0.05）,与蛋白组学结果一致。结论P38抑制剂并不是通过单一途径改善SAH后神经细胞线粒体功能障碍,而与多种蛋白及信号通路的调控有关,Rab7a蛋白可能是早期异常自噬的重要靶点。
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