日本脑炎(Japanese encephalitis,JE)又称流行性乙型脑炎,是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染引起的急性中枢神经系统疾病,具有较高的致死率和致残率。尽管JEV疫苗有比较理想的保护效应,但根据WHO报道,全球每年仍有约6.8万人感染发病,其中有20~30%死亡,幸存者中又有30~50%伴有严重的神经精神后遗症。JEV以感染儿童为主,而近年来老年人发病率呈现逐渐上升趋势。对于JE的治疗,迄今尚无特异有效的方法,仅能以对症支持治疗为主,给患者和家庭带来极大的痛苦。JEV具有嗜神经性,既可直接引起神经元的损伤与死亡,又可通过免疫病理反应损伤神经元细胞,并诱导小胶质细胞的大量活化和炎症因子的产生,进而加剧血脑屏障的破坏和免疫细胞的浸润。其中,神经元的死亡、小胶质细胞的活化和炎症因子的大量释放可相互促进,形成免疫病理损伤的恶性循环加重疾病的进展。因此,深入研究JEV诱导神经元死亡的机制,以及探索有效的免疫调控方式抑制过度的炎症反应对于JEV治疗新策略的开发具有重要意义。神经元的死亡是JE发生发展的关键,细胞凋亡和自噬均参与了JEV导致的神经元死亡,但阻断凋亡和自噬不能完全抑制神经元的死亡,提示神经元可发生其它形式的死亡。程序性坏死是一种特殊的细胞坏死方式,主要由TNF/RIPK1(receptor-interacting protein kinase 1)/RIPK3/MLKL(mixed-lineage kinase domain-like protein)信号通路调控。鉴于TNF-α是JEV致病的重要炎症因子,JE死亡患者脑组织中大量神经元发生坏死,为此我们探讨了MLKL介导的程序性坏死是否参与JE进展。过度免疫反应所导致的炎症损伤是JE的主要致病原因。抑制过度的炎症反应,改善损伤微环境,促进神经系统的再生修复是治疗JE的关键和挑战。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。MSC因具有强大的免疫调节和靶向迁移能力而受到广泛关注。大量研究显示MSC可抑制过度的炎症反应,维持机体免疫稳态;同时可分泌多种生长因子和神经营养因子促进神经组织的再生修复;MSC还可提高血管内皮细胞的稳定性,减少血脑屏障的破坏。MSC在多种中枢神经系统疾病模型中有着很好的治疗作用,因此探索MSC在JE中的治疗作用意义重大。同时,近年来研究发现生长停滞特异性蛋白(growth arrest-specific protein 6,Gas6)可调控小胶质细胞的活化,调节脑血管内皮细胞功能,参与血管重塑和血脑屏障完整性的维持,并且它可改善少突胶质细胞的功能状态促进髓鞘的形成和组织功能修复。因此,我们初步探讨了MSC及gas6基因修饰的MSC在JE治疗中的效应及机制。本研究的主要实验方法及结果:1.MLKL介导的程序性坏死在JEV感染所致中枢神经系统炎症损伤中的作用应用C6/36细胞扩增JEV并通过超高速离心浓缩病毒,空斑形成实验测定病毒滴度为4×108 PFU/ml。采用C57BL/6小鼠(雌,4~6周龄),通过腹腔注射途径感染JEV(5×107 PFU/只)构建小鼠JE模型,观察神经行为学变化、结合脑组织内病毒E抗原染色及脑内TNF-α水平进行JE模型鉴定。活体PI(碘化丙啶)染色联合电镜技术发现JEV感染模型中脑细胞坏死的发生。JEV感染脑组织切片,通过组织免疫荧光、免疫电镜检测到JEV感染后脑细胞MLKL表达水平显著升高且主要分布在细胞质,并有向细胞膜募集趋势;MLKL与NeuN共染结果显示MLKL介导的程序性坏死主要发生在神经元;蛋白印迹结果显示JEV感染后脑组织内MLKL及磷酸化MLKL(pMLKL)蛋白水平明显升高;qRT-PCR结果显示JEV感染可诱导脑组织MLKL表达且MLKL在症状严重的小鼠中表达水平更高。同时,我们构建Neuro2a细胞的JEV体外感染模型,并给以不同的MOI值和感染时间,qRT-PCR及western blot检测结果显示随着JEV感染时间及剂量的增加,MLKL及pMLKL蛋白水平及MLKL的mRNA水平都随之增加。进一步,我们使用MLKL敲除(MLKL-/-)小鼠及野生型(WT)小鼠进行攻毒实验,结果发现,与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠感染JEV后呈现出缓慢的病程进展和较低的炎症因子水平。2.MSC移植对于JEV感染所致炎症损伤的治疗作用首先我们采用全骨髓贴壁法分离培养纯化小鼠骨髓MSC,通过表面标志分子检测和成脂成骨成软骨细胞三系体外诱导分化实验证实分离的MSC符合干细胞鉴定的国际标准。然后采用8~10周龄BALB/c小鼠构建JE模型,并于感染后第1,3天经尾静脉注射途径进行MSC移植,并对各组小鼠状态变化进行观察记录及组织病理学检测,结果显示MSC移植可降低JEV感染所致的死亡率,改善临床症状,缓解中枢神经系统的组织病理损伤和炎症反应。同时,组织免疫荧光、流式细胞术、TUNEL染色、血脑屏障渗透性检测和qRT-PCR等检测结果显示:在MSC移植模型中脑组织IBA1表达下调即小胶质细胞活化程度下降;脑组织NeuN表达增加,TUNEL染色阳性比例下降;血脑屏障的渗透性降低,紧密连接蛋白ZO-1表达增加;脑组织E抗原水平降低,脑内病毒载量下降。进一步进行体外实验,将MSC分别与Neuro2a细胞和N9细胞混合培养或Transwell共培养,流式细胞术及qRT-PCR等检测结果显示:与MSC共培养可提高Neuro2a细胞的存活率,并调控小胶质细胞M1向M2极化状态的转变;在共培养的条件下MSC可上调表达免疫调节因子(如TSG-6,TGF-β)、干扰素(如IFN-α,IFN-β)和干扰素诱导基因等;当MSC与JEV感染的Neuro2a细胞进行混合培养或共培养时,JEV的增殖被抑制。3.基因修饰MSC的构建及其功能作用的初步验证采用慢病毒感染的方法,构建并筛选获得Fluc-MSC。JEV感染BALB/c小鼠(雌,6-8周龄)后第1、3天经尾静脉途径进行Fluc-MSC移植,同时以PBS静脉注射为对照组。第6天使用荧光素酶底物检测脑组织内Fluc的表达,与对照组相比,Fluc-MSC移植组小鼠脑组织中冷光值明显升高,提示在JE模型中,尾静脉移植的MSC可迁移至脑组织。同时,分离扩增出完整的gas6基因片段,构建p Lenti-gas6-GZ载体,并包装慢病毒。将其通过离心法感染MSC并用zeocin药物筛选出纯度较高的gas6-MSC。进一步在JEV感染小鼠后第1,3天分别进行MSC、gas6-MSC尾静脉移植治疗。初步实验结果表明在JE模型中,与MSC相比,gas6-MSC移植组显示出更高的存活率和改善的临床症状。讨论与结论:JEV是目前导致病毒性脑炎的主要原因,JE具有极高的致死率和致残率。神经元的死亡和脑内过度免疫损伤是JE发生发展的关键,然而目前对于神经元死亡的具体机制以及有效的免疫调控治疗都缺乏足够的认识。本实验中,我们探索了MLKL介导的程序性坏死在JE中的作用以及MSC对于JE的免疫调控作用并初步探索MSC的优化治疗方案。我们得出以下结论,MLKL介导的程序性坏死参与JEV感染所致的神经元死亡,抑制MLKL的表达可缓解疾病的进展和炎症因子水平;MSC移植能缓解JEV感染所致的炎症损伤和死亡率,而且,在一定程度上,MSC可以抑制JEV的增殖;同时我们成功构建了gas6-MSC,初步证实gas6-MSC移植治疗能更有效地改善JE模型的生存率。本研究为深入理解JEV的致病机制,探索有效的治疗方法提供了实验基础。