论文部分内容阅读
研究目的（1）研究基质重建相关蛋白5（Matrix-remodeling associated 5,MXRA5）在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者肿瘤组织的表达,并分析其蛋白表达水平的高低与患者临床病理特征及预后生存之间的关系。（2）研究趋化因子CXC受体4（CXC chemokin receptor-4,CXCR4）在肺癌细胞系中的表达;构建CXCR4 sh RNA下调CXCR4在肺癌细胞中的表达;探讨CXCR4对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其相关的作用机制。方法（1）收集30例新鲜NSCLC患者癌组织及相应的癌旁正常组织,Real-time PCR法检测MXRA5 m RNA表达水平。（2）免疫组化法检测l66例NSCLC患者癌组织及相应的癌旁正常组织中MXRA5蛋白表达水平。（3）结合患者临床病理特征及预后生存数据,分析MXRA5蛋白表达在NSCLC患者中的临床意义。（4）Real-time PCR和Western blot分别检测肺正常上皮细胞株（beas-2b）、肺腺癌细胞（A549）和肺鳞癌细胞株（SK-MES-1）中CXCR4 m RNA和蛋白表达水平。（5）构建CXCR4sh RNA质粒,慢病毒包装后转染A549肺癌细胞株,Western blot验证CXCR4sh RNA干扰效果。（6）CXCR4 sh RNA转染A549细胞株,Western blot检测A549细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）相关标记物蛋白水平和凋亡相关蛋白表达;流式细胞仪检测A549细胞凋亡;细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）检测A549细胞增殖;Caspase酶活性检测试剂盒检测A549细胞Caspase相关酶活性;（7）CXCR4 sh RNA转染A549细胞株,Western blot检测P-AKT和AKT蛋白表达;流式检测刺激或抑制AKT蛋白表达对A549细胞凋亡影响;（8）CXCR4 sh RNA转染A549细胞株,Western blot检测刺激或抑制NF-κB蛋白表达后NF-κB信号通路相关蛋白表达情况;荧光素酶报告基因检测NF-κB活性;流式检测刺激或抑制NF-κB表达后A549细胞凋亡情况。（9）CXCR4sh RNA转染A549细胞株,Western blot检测刺激或抑制AKT蛋白表达后,NF-κB信号通路相关蛋白表达情况;荧光素酶报告基因检测转录因子NF-κB活性变化。结果:（1）NSCLC患者癌组织中MXRA5的m RNA表达水平高于相应的癌旁正常组织;其中鳞癌（SCC）MXRA5 m RNA升高的倍数为3.372±1.143（P<0.01）,腺癌（AC）MXRA5 m RNA升高的倍数为2.455±0.929（P<0.01）。（2）MXRA5蛋白在NSCLC患者癌组织中的高表达率为46.99%（78/166）;在癌旁正常组织中的高表达率仅为4.82%（8/166）;SCC和AC癌组织免疫组化评分均明显高于相应癌旁正常组织（P<0.01）。（3）MXRA5蛋白的表达水平与患者年龄、癌组织分化程度、TNM分期和吸烟史显著相关（P<0.05）;COX比例风险模型多因素回归分析显示TNM分期和MXRA5蛋白高表达为NSCLC患者的独立预后因素。（4）CXCR4表达在肺癌细胞系A549和SK-MES-1中均升高,在A549肺腺癌细胞株中增高最为明显。（5）成功构建CXCR4 sh RNA,转染A549腺癌细胞后显著降低CXCR4表达。（6）CXCR4表达降低后,A549细胞中E-cadherin蛋白表达明显增加,N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显降低;A549细胞凋亡增加,细胞增殖降低;促凋亡蛋白Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白表达增高;Caspase凋亡蛋白酶活性增高;加入相应Caspase酶抑制剂,A549细胞凋亡增加。（7）CXCR4表达降低后,p-AKT和AKT蛋白表达降低;刺激p-AKT表达抑制A549细胞凋亡,抑制p-AKT表达促进A549细胞凋亡;（8）CXCR4表达降低后,NF-κB信号通路相关蛋白p50、p52、p65、c-Rel和Rel B表达降低;NF-κB活性降低;刺激NF-κB表达A549细胞凋亡减少,抑制NF-κB表达促进A549凋亡;（9）CXCR4表达降低后,刺激AKT表达,NF-κB信号通路相关蛋白p50、p52、p65、c-Rel和Rel B表达增加,NF-κB活性增加,A549细胞凋亡减少;抑制AKT表达,NF-κB信号通路相关蛋白p50、p52、p65、c-Rel和Rel B表达减少,NF-κB活性降低,A549细胞凋亡增加。结论:（1）在NSCLC癌组织MXRA5 m RNA和蛋白表达增多。（2）MXRA5蛋白的表达水平与年龄、癌组织分化程度、TNM分期和吸烟史显著相关。（3）MXRA5蛋白是NSCLC患者的独立预后因素。（4）CXCR4在肺癌细胞中表达增加,在A549肺腺癌细胞株表达增高最明显。（5）通过CXCR4 sh RNA降低A549肺腺癌细胞株中CXCR4中的表达后,促进了A549细胞的凋亡,抑制了A549细胞增殖。（6）转染了CXCR4 sh RNA之后,抑制了A549细胞的EMT改变。（7）CXCR4通过调节Caspase相关酶活性促进A549细胞凋亡。（8）CXCR4通过调节PI3K/AKT信号通路蛋白表达,进而调控NF-κB信号家族相关蛋白的表达和核转录因子NF-κB活性,介导A549细胞凋亡。