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本文从以下两个部分进行探讨：
第一部分 WIN55，212－2联合金诺芬对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响
目的：
大麻作为已被使用治疗某些疾病有多个世纪的草药，本身有抗肿瘤的活性,能够在体外抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡。金诺芬是一种具有抗炎作用的磷化烃金化合物。近年来，金诺芬对肿瘤细胞的细胞毒作用得到了证实，是一个有潜力的肿瘤靶向治疗的药物。但该两种药物联用抗肿瘤的临床和实验研究目前尚未有报道。因此，探讨大麻素受体激动剂WIN55，212-2（WIN）联合金诺芬（Auranofin，AF）对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响，并对其机制进行初步研究。
方法：
分别用5μmol/L WIN、0.25μmol/L AF、5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF处理HepG2细胞24h和48h后，MTS法检测细胞活力；采用AnnexinV-FITC和PI双染色法并通过流式细胞仪分析细胞凋亡；Western blot检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bip、ATF4、PARP、Caspase3、Caspase8、Caspase9）表达的变化。分别用5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF、Z-VAD-FMK以及Z-VAD-FMK预处理1h后再用5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF处理HepG2细胞24h，Western blot检测蛋白PARP、Caspase3、Caspase8、Caspase9的变化。
结果：
与两药单独使用相比，WIN联合AF明显抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，可以引起Bcl-2蛋白表达水平下调，内质网应激反应相关蛋白Bip、ATF4蛋白表达水平上调，以及活化Caspase3、Caspase8、Caspase9，引起PARP蛋白的切割。加入Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞后，能部分逆转联合用药的细胞凋亡比例。
结论：
WIN55，212-2联合金诺芬能有效诱导肝癌细胞凋亡，其机制可能与Bcl-2表达下调，内质网应激反应和Caspase系统活化相关。
第二部分 TSPAN31下调其靶基因CDK4抑制子宫颈癌细胞的增殖
目的：
天然反义转录物（natural antisense transcripts,NATs）是一类能够与其互补的RNAs通过碱基配对方式，形成正义-反义RNAs双链的内源性RNA分子。NATs作为调控基因表达的重要分子，在哺乳动物基因中广泛存在，对疾病的病理和生理方面起着重要的作用。然而，NATs在肿瘤中的生物学功能和相关机制仍不清楚。在NCBI和NATsDB数据库显示TSPAN31与CDK4是一对顺式的天然反义转录物。本课题着重探讨天然反义转录本TSPAN31是否对其靶基因CDK4有调控作用，再深入一步研究它们对子宫颈癌细胞的影响和意义。
方法：
在NCBI和天然反义转录物数据库（NATsDB）中查阅TSPAN31和CDK4之间存在的关系；针对TSPAN31与CDK4非互补区设计siRNA，在子宫颈癌细胞中，特异性沉默TSPAN31，利用Western Blot和q-PCR的实验技术检测CDK4蛋白水平和mRNA水平的变化；针对TSPAN31的CDS区、3’UTR区以及全长，构建了3个过表达质粒，分别转染到HEK-293T和Hela细胞中，利用Western Blot和q-PCR、补救实验以及双荧光素酶报告基因检测的实验技术，进一步研究TSPAN31对CDK4发挥调节作用区域。利用克隆形成实验和MTS实验研究沉默和过表达TSPAN31后，对子宫颈癌细胞增殖的影响；构建sh-TSPAN31Hela稳定细胞株，利用Western Blot检测CDK4和RB、p-RB蛋白的水平的变化；利用BALB/c裸鼠建立沉默TSPAN31基因表达的成瘤模型，探究TSPAN31在体内是否影响子宫颈癌细胞的增殖。
结果：
NCBI数据库显示TSPAN31mRNA和CDK4mRNA在3’UTR区有517个碱基重叠，NATsDB数据库显示TSPAN31和CDK4是一对顺式天然反义转录物本（cis-NATs）。利用siRNA特异性地沉默TSPAN31表达后，CDK4在蛋白水平和mRNA水平均表达上调。在HEK-293T和Hela细胞中分别过表达TSPAN31CDS区、3’UTR区和全长后，与空载体相比，过表达TSPAN31-3’UTR，TSPAN31-full length均能明显下调CDK4表达，而TSPAN31-CDS过表达质粒对CDK4的表达无明显调节作用。补救实验和双荧光素酶报告基因检测结果显示TSPAN31主要在3’UTR区调节CDK4。
沉默和过表达TSPAN31后，对子宫颈癌细胞生长有明显的影响。ShRNA沉默TSPAN31后能够上调CDK4、p-RB蛋白的表达，对RB蛋白无影响。利用BALB/c裸鼠建立沉默TSPAN31基因表达的成瘤模型发现，TSPAN31沉默明显促进子宫颈癌体内移植瘤的生长。
结论：
我们研究发现，天然反义转录物TSPAN31mRNA调控CDK4，主要通过3’UTR区抑制CDK4基因的表达。此外，TSPAN31在体内和体外影响子宫颈癌细胞的增殖。
第一部分 WIN55，212－2联合金诺芬对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响
目的：
大麻作为已被使用治疗某些疾病有多个世纪的草药，本身有抗肿瘤的活性,能够在体外抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡。金诺芬是一种具有抗炎作用的磷化烃金化合物。近年来，金诺芬对肿瘤细胞的细胞毒作用得到了证实，是一个有潜力的肿瘤靶向治疗的药物。但该两种药物联用抗肿瘤的临床和实验研究目前尚未有报道。因此，探讨大麻素受体激动剂WIN55，212-2（WIN）联合金诺芬（Auranofin，AF）对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响，并对其机制进行初步研究。
方法：
分别用5μmol/L WIN、0.25μmol/L AF、5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF处理HepG2细胞24h和48h后，MTS法检测细胞活力；采用AnnexinV-FITC和PI双染色法并通过流式细胞仪分析细胞凋亡；Western blot检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bip、ATF4、PARP、Caspase3、Caspase8、Caspase9）表达的变化。分别用5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF、Z-VAD-FMK以及Z-VAD-FMK预处理1h后再用5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF处理HepG2细胞24h，Western blot检测蛋白PARP、Caspase3、Caspase8、Caspase9的变化。
结果：
与两药单独使用相比，WIN联合AF明显抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，可以引起Bcl-2蛋白表达水平下调，内质网应激反应相关蛋白Bip、ATF4蛋白表达水平上调，以及活化Caspase3、Caspase8、Caspase9，引起PARP蛋白的切割。加入Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞后，能部分逆转联合用药的细胞凋亡比例。
结论：
WIN55，212-2联合金诺芬能有效诱导肝癌细胞凋亡，其机制可能与Bcl-2表达下调，内质网应激反应和Caspase系统活化相关。
第二部分 TSPAN31下调其靶基因CDK4抑制子宫颈癌细胞的增殖
目的：
天然反义转录物（natural antisense transcripts,NATs）是一类能够与其互补的RNAs通过碱基配对方式，形成正义-反义RNAs双链的内源性RNA分子。NATs作为调控基因表达的重要分子，在哺乳动物基因中广泛存在，对疾病的病理和生理方面起着重要的作用。然而，NATs在肿瘤中的生物学功能和相关机制仍不清楚。在NCBI和NATsDB数据库显示TSPAN31与CDK4是一对顺式的天然反义转录物。本课题着重探讨天然反义转录本TSPAN31是否对其靶基因CDK4有调控作用，再深入一步研究它们对子宫颈癌细胞的影响和意义。
方法：
在NCBI和天然反义转录物数据库（NATsDB）中查阅TSPAN31和CDK4之间存在的关系；针对TSPAN31与CDK4非互补区设计siRNA，在子宫颈癌细胞中，特异性沉默TSPAN31，利用Western Blot和q-PCR的实验技术检测CDK4蛋白水平和mRNA水平的变化；针对TSPAN31的CDS区、3’UTR区以及全长，构建了3个过表达质粒，分别转染到HEK-293T和Hela细胞中，利用Western Blot和q-PCR、补救实验以及双荧光素酶报告基因检测的实验技术，进一步研究TSPAN31对CDK4发挥调节作用区域。利用克隆形成实验和MTS实验研究沉默和过表达TSPAN31后，对子宫颈癌细胞增殖的影响；构建sh-TSPAN31Hela稳定细胞株，利用Western Blot检测CDK4和RB、p-RB蛋白的水平的变化；利用BALB/c裸鼠建立沉默TSPAN31基因表达的成瘤模型，探究TSPAN31在体内是否影响子宫颈癌细胞的增殖。
结果：
NCBI数据库显示TSPAN31mRNA和CDK4mRNA在3’UTR区有517个碱基重叠，NATsDB数据库显示TSPAN31和CDK4是一对顺式天然反义转录物本（cis-NATs）。利用siRNA特异性地沉默TSPAN31表达后，CDK4在蛋白水平和mRNA水平均表达上调。在HEK-293T和Hela细胞中分别过表达TSPAN31CDS区、3’UTR区和全长后，与空载体相比，过表达TSPAN31-3’UTR，TSPAN31-full length均能明显下调CDK4表达，而TSPAN31-CDS过表达质粒对CDK4的表达无明显调节作用。补救实验和双荧光素酶报告基因检测结果显示TSPAN31主要在3’UTR区调节CDK4。
沉默和过表达TSPAN31后，对子宫颈癌细胞生长有明显的影响。ShRNA沉默TSPAN31后能够上调CDK4、p-RB蛋白的表达，对RB蛋白无影响。利用BALB/c裸鼠建立沉默TSPAN31基因表达的成瘤模型发现，TSPAN31沉默明显促进子宫颈癌体内移植瘤的生长。
结论：
我们研究发现，天然反义转录物TSPAN31mRNA调控CDK4，主要通过3’UTR区抑制CDK4基因的表达。此外，TSPAN31在体内和体外影响子宫颈癌细胞的增殖。