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研究背景与目的脊髓顿挫伤(Spinal Cord Contusion,SCC)是一种严重的中枢神经系统损伤,大部分情况下因中枢神经系统的低再生能力造成病人的永久性瘫痪,给个人、家庭和社会带来了非常严重的危害。由于神经元内部的机制和细胞外环境障碍的影响,脊髓顿挫伤后神经元及神经元轴突几乎无法进行再生修复。在脊髓顿挫伤的过程中,炎症以及神经元有限的再生能力是影响脊髓顿挫伤修复的重要因素。白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)是一种重要的抗炎症因子,对于减少SCC后的炎症反应、兴奋毒性损伤和神经细胞凋亡具有十分重要的作用,IL-10作为一种基因治疗的靶点是一种潜在的治疗方法。在脊髓顿挫伤后,睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一种修复SCC的重要的神经生长因子,能够防止受损神经元的变性和死亡,对受损的神经元尤其是运动神经元起保护作用。但是,在SCC后,抑制IL-10的表达是否会影响CNTF的表达,从而进一步影响SCC运动功能的修复仍然还不清楚。因此,本研究的目的是探究脊髓顿挫伤后IL-10和CNTF的相互关系以及对大鼠SCC修复的影响。材料与方法第一部分将Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成脊髓顿挫伤(SCC)组和假手术(Sham)组,采用Allen’s打击法制备脊髓顿挫伤动物模型,用Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动量表对大鼠的运动功能进行评价。用实时定量聚合酶链反应技术(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)、免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)等技术对脊髓中的IL-10和CNTF的基因和蛋白定位表达进行检测。第二部分将SD大鼠随机分成慢病毒抑制(IL-10-RNAi-LV)组和空载(Vector)组,在脊髓顿挫伤48 h前,采用慢病毒介导的基因干扰(RNAi)技术抑制IL-10的表达。利用生物信息学方法GeneMANIA分析预测IL-10和CNTF之间的关系。BBB评分评估IL-10抑制后大鼠的运动功能变化。用qPCR和IHC对IL-10抑制后脊髓中的CNTF的基因和蛋白定位表达进行检测。结果一、IL-10和CNTF的表达变化1.实验动物模型评价:脊髓钝挫伤后,大鼠后肢出现瘫痪,BBB评分为0,此后逐渐升高,到第14天明显恢复,但无法恢复到损伤前的评分,提示造模成功。2.IL-10和CNTF的基因表达:qPCR的结果表明,与假手术组相比,IL-10mRNA在SCC 6 h和12 h显著上调(P<0.05),在第7 d和14 d显著下调(P<0.05)。另外,脊髓顿挫伤后CNTF及其受体(Ciliary neurotrophic factor receptor,CNTFR)mRNA的表达也显著下调(P<0.05)。3.IL-10和CNTF的蛋白定位表达:免疫组化和免疫荧光的结果提示脊髓钝挫伤后IL-10和CNTF均定位于脊髓灰质前角的神经元细胞胞质。二、IL-10和CNTF的调控机制1.生物信息学的结果:GeneMANIA分析提示IL-10与CNTF具有相互作用的蛋白质分子作用结构域,说明IL-10与CNTF在功能上是相似的。2.抑制IL-10后SCC大鼠运动功能的变化结果:在IL-10抑制组(RNAi-IL-10),大鼠的BBB评分与空载组(Vector)相比,在第5 d和7 d显著下降(P<0.05)。因此,IL-10抑制后,SCC大鼠的运动功能减弱。3.抑制IL-10后CNTF的基因表达:qPCR的结果提示,与空载组相比,在IL-10抑制后病毒组的CNTF mRNA表达明显上调(P<0.05)。4.抑制IL-10后CNTF的蛋白定位表达:免疫组化的结果提示,IL-10表达抑制后CNTF定位于脊髓前角灰质的神经元胞质中。结论1.在SCC早期IL-10的表达增加,此后,IL-10的表达逐渐降低;同时,脊髓顿挫伤后CNTF、CNTFR的表达也下降,实验结果提示脊髓顿挫伤影响IL-10和CNTF的表达,IL-10和CNTF参与脊髓顿挫伤后大鼠后肢运动功能的恢复。2.慢病毒介导的RNAi技术抑制IL-10表达后,CNTF表达明显上升,实验结果提示IL-10降低导致CNTF的表达增加,CNTF通过偿性增高而影响SCC的修复,为脊髓顿挫伤的基因靶向治疗提供了新的视角。