论文部分内容阅读
目的:在细胞水平和动物水平上分别观察m TOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)对阿尔茨海默病炎症模型的保护作用,探究RAPA对阿尔茨海默病炎症模型的抗炎机制。方法:本课题主要是通过用Aβ25-35、LPS处理N2a细胞和C57小鼠、KM小鼠建立炎症模型,并在此基础上设置RAPA给药组,应用Western Blot检测m TOR、p-m TOR(Ser2448)、Stat3、p-Stat3(Ser727)、NF(?)B、p-NF(?)B(Ser536)、TNFα、IL-1β、Bcl-2、Bax的蛋白表达量;利用MTT和Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞仪检测细胞活性及凋亡情况;结合细胞和组织免疫荧光染色技术探究由Aβ25-35引发的N2a细胞m TOR/NF(?)B核质分布变化及小鼠海马区星形胶质细胞数目增加的情况;对N2a细胞转染NF(?)B质粒和I(?)B突变质粒,检测各相关蛋白表达量的改变。结果:在细胞水平上,N2a细胞分别经过Aβ25-35处理6h和LPS处理1h后,m TOR、p-m TOR(Ser2448)、Stat3、p-Stat3(Ser727)、NF(?)B、p-NF(?)B(Ser536)、TNFα、IL-1β和Bax的蛋白表达量较对照组显著上升,Bcl-2蛋白表达量较对照组显著下降(p<0.05),在RAPA预处理1.5h,然后加入Aβ25-35或LPS(Aβ25-35+RAPA或LPS+RAPA组)处理细胞6h或1h,发现RAPA抑制了Aβ25-35或LPS诱导的目的蛋白的表达(p<0.05);N2a细胞转染NF(?)B质粒后,m TOR、Stat3、NF(?)B及其磷酸化水平的蛋白表达量较对照组均显著上升(p<0.05),NF(?)B+RAPA组各目的蛋白表达量均显著下降(p<0.05);N2a细胞经过Aβ25-35处理6h后,细胞免疫荧光检测m TOR和NF(?)B均出现核转移现象,但RAPA+Aβ25-35组的m TOR和NF(?)B入核现象被抑制;N2a细胞转染NF(?)B质粒后,有部分NF(?)B入核,但当用RAPA预处理后,出现抑制NF(?)B入核的现象;N2a细胞转染I(?)B突变质粒后,I(?)B和I(?)B+LPS处理组的m TOR、Stat3、NF(?)B及其磷酸化水平的蛋白表达量均无明显差异(p>0.05);MTT检测发现,N2a细胞经过Aβ25-35处理6h或LPS处理1h,细胞活性显著降低(p<0.05),RAPA+Aβ25-35组和RAPA+LPS组细胞活性均有所回升(p<0.05);流式细胞术检测发现,N2a细胞经过Aβ25-35处理6h后,凋亡率从对照组的2.96%增至8.57%,但RAPA+Aβ25-35组凋亡率为3.91%。在动物水平上,C57小鼠经过脑立体定位注射Aβ25-35后,m TOR、p-m TOR(Ser2448)、Stat3、p-Stat3(Ser727)、NF(?)B、p-NF(?)B(Ser536)、TNFα、IL-1β和Bax的蛋白表达量较对照组显著上升,Bcl-2蛋白表达量较对照显著下降(p<0.05),RAPA+Aβ25-35组较Aβ25-35组除Bcl-2蛋白表达量显著上升,其他目的蛋白表达量均显著下降(p<0.05);KM小鼠尾静脉注射LPS后,m TOR、p-m TOR(Ser2448)、Stat3、p-Stat3(Ser727)、NF(?)B、p-NF(?)B(Ser536)、TNFα、IL-1β和Bax的蛋白表达量较对照组显著上升,Bcl-2蛋白表达量较对照组显著下降(p<0.05),RAPA+LPS组较LPS组除Bcl-2蛋白表达量显著上升,其他目的蛋白表达量显著下降(p<0.05);冰冻切片免疫荧光检测GFAP的增殖情况,发现Aβ25-35组和LPS组较对照组和RAPA(Aβ25-35+RAPA或LPS+RAPA)共处理组共处理组星形胶质细胞数量增加。结论:Aβ能引起神经元炎症,在细胞和小鼠模型中,m TOR的磷酸化水平明显增高,提示m TOR途径在神经元炎症中发挥重要作用;雷帕霉素对Aβ或LPS引起的神经元炎症有一定的保护作用,其抗炎机制可能是雷帕霉素抑制m TOR通路,通过下调Stat3的表达及抑制NF(?)B入核。