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目的:1.通过统计江西省某三甲医院2017年至2019年肺炎克雷伯菌临床分离株对常见抗生素的敏感性,阐明近年来我省肺炎克雷伯菌的耐药情况。2.筛选出对多粘菌素耐药的肺炎克雷伯菌,并评估快速多粘菌素敏感实验的可操作性及实用性,为后续快速鉴定多粘菌素耐药的肺炎克雷伯菌提供依据。3.通过分析该医院多粘菌素耐药肺炎克雷伯菌全基因组序列,探究其对多粘菌素耐药的分子机制,为后续开展分子生物学检测提供数据支撑。方法:1.使用世界卫生组织(WHO)推荐的WHONET5.6分析软件,对临床肺炎克雷伯菌在该三甲医院的分布、耐药率等情况进行统计分析。2.依照临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐方法,对肺炎克雷伯菌多粘菌素耐药进行测定。肉汤稀释法确定最低抑菌浓度(MIC),折点参考欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)。3.采用多位点序列分型技术(MLST),对肺炎克雷伯菌7个管家基因(gapA、infB、rpoB、mdh、tonB、pgi及phoE)进行PCR扩增并测序,将测序结果提交至https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html网站进行比对,获得等位基因的类型,再根据七个等位基因的类型比对出耐多粘菌素的肺炎克雷伯菌株的ST分型。4.提取多粘菌素耐药的肺炎克雷伯菌全基因组,借助Illumina测序平台,完成全基因组测序工作。结果:1.近三年2017年、2018年、2019年该医院共分离到肺炎克雷伯菌1482株,分别为452株、468株和562株,发现其在所有临床分离的革兰阴性杆菌中的占比逐年增高;三年的分离率分别是18.23%、19.91%和21.69%。其中肺炎克雷伯菌分离最多的科室为神经外科235株(15.9%),ICU210株(14.2%),呼吸科152株(10.3%),肝胆外科136株(9.2%),肿瘤科102株(8.6%),泌尿科88株(5.9%)和心胸外科75株(5%)。主要标本种类包括血液标本489株(33%),痰液标本466株(31.4%),尿液标本189株(12.8%)和伤口分泌物84株(5.7%)。2.近三年来临床分离的1482株肺炎克雷伯菌分别对常用13种抗菌药物(哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明和呋喃妥因)的耐药率统计如下:耐药率最高的是头孢唑林达到了60.2%,头孢曲松耐药率51.1%,处于40%-50%耐药率的是氨曲南和呋喃妥因,亚胺培南的耐药率为19.1%,其中阿米卡星的耐药率最低,只有8.2%。对分离肺炎克雷伯菌最多的两个科室神经外科和ICU的耐药率与其他科室比较,发现这两个科室肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物耐药率普遍比总的耐药率高,尤其是神经外科的耐药率,其中头孢唑林、头孢曲松、氨曲南的耐药率都超过了60%,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、环丙沙星、左旋氧氟沙星和呋喃妥因的耐药率超过了50%,并且对碳青霉烯类抗生素的耐药率达到了44.3%,比ICU的29.9%高了14.4%。3.收集721株临床分离的肺炎克雷伯菌,使用肉汤稀释法测出最低抑菌浓度,参考欧洲抗菌药物敏感性试验委员会制定的多粘菌素折点,筛选得到了多粘菌素耐药肺炎克雷伯菌(polymyxin resistant Klebsiella pneumoniae,PolR-Kpn)22株。经过耐药基因扩增,22株耐药菌中有4株携带mcr相关耐药基因,其中mcr-1耐药基因有3株,mcr-8耐药基因1株;18株耐药菌为染色体介导的耐药,其中10株为双组分系统PmrAB基因突变,4株为mgrB基因突变,4株为双组份系统PhoPQ基因突变。对17株耐多粘菌素的肺炎克雷伯菌进行ST分型,其中Kpn3,Kpn15,Kpn22和Kpn23为ST11型,Kpn9为ST22型,Kpn4为ST25型,Kpn12为ST105型,Kpn19为ST218型,Kpn30为ST294型,Kpn8为ST367型,Kpn18为ST378型,Kpn11为ST592型,Kpn1、Kpn2和Kpn21为ST3918型,Kpn7和Kpn17未测出其ST型。4.快速多粘菌素耐药实验表明,在22株多粘菌素耐药肺炎克雷伯菌中,20株呈现阳性,2株阴性,而12株多粘菌素敏感肺炎克雷伯菌全部阴性。改良快速多粘菌素实验显示,3株携带mcr-1耐药基因肺炎克雷伯菌全部阴性,1株携带mcr-8耐药基因肺炎克雷伯菌呈现出敏感表型。5.对多粘菌素耐药的肺炎克雷伯菌进行全基因组测序,发现3株携带mcr-1耐药基因(Kpn4、Kpn18和Kpn30),1株携带mcr-8耐药基因(Kpn23)。进一步的生物信息学分析发现,Kpn4和Kpn30株的mcr-1可能存在于质粒中,并且Kpn30株同时存在mcr-1耐药基因和phoP基因突变。结论:1、肺炎克雷伯菌是导致医院内感染的重要条件致病菌,其耐药率逐年增加,尤其是对碳青霉烯类抗生素耐药率,其中以神经外科和ICU科室分离出的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药率最高。2、经微量肉汤稀释法筛选的721株肺炎克雷伯菌,共有22株对多粘菌素耐药,其中三株携带mcr-1耐药基因,一株携带mcr-8耐药基因,评估快速多粘菌素耐药实验,发现其能够较好地筛查多粘菌素耐药的肺炎克雷伯菌,可为耐多粘菌素的肺炎克雷伯菌监测提供初筛手段。3、经多粘菌素耐药的肺炎克雷伯菌全基因组测序,结合生物信息学分析发现,该医院质粒介导的多粘菌素耐药基因主要是mcr-1,因此,提示我们应及早采取相应的主动筛查措施。