【摘 要】
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本文根据Genebank中提交的序列设计引物,用PCR方法扩增了解脂耶氏酵母的三段rDNA、三种启动子pXPR2,pTEF、pRPS7以及终止子XPR2t.PCR产物克隆到PMD18-T载体,测序结果与Geneba
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本文根据Genebank中提交的序列设计引物,用PCR方法扩增了解脂耶氏酵母的三段rDNA、三种启动子pXPR2,pTEF、pRPS7以及终止子XPR2t.PCR产物克隆到PMD18-T载体,测序结果与Genebank中序列一致.同时,用PCR方法从啤酒酵母中克隆了蔗糖转换酶基因SUC2,并构建了以SUC2基因为选择标记的rDNA介导的解脂耶氏酵母整合表达载体pHBM552+T52.此载体用Tth111I线形化后转化了解脂耶氏酵母菌株2.1502.转化子用PCR方法进行了鉴定,结果正确.构建了包含甘露聚糖酶基因表达单元的解脂耶氏酵母整合表达载体,转化解脂耶氏酵母菌株2.1502,带pRPS7启动子的载体得到的转化子在LBS平板上检测到了甘露聚糖酶活性.而在pXPR2启动子指导下的甘露聚糖酶基因在诱导平板上未能检测到表达.用带啤酒酵母α因子信号肽序列的黑曲霉植酸酶基因置换甘露聚糖酶基因使其置于pRPS7启动子指导下的,并转化解脂耶氏酵母,转化子在添加植酸钙的YPD平板上检测到了植酸酶活性.为了提高载体的稳定性,我们置换了载体上作为整合位点的rDNA,并将载体上的大肠杆菌复制起始位点和氨苄青霉素抗性基因插入到rDNA中间.在转化酵母之前将大肠杆菌复制起始位点和氨苄青霉素抗性基因切除,剩余的片段纯化后转化解脂耶氏酵母.通过这种方法得到了转化子稳定性大大提高了的整合载体.为了提高蛋白质的表达水平,我们构建了一系列基于pXPR2的上游激活序列(UAS)的串联重复和pTEF以及pRPS7启动子的TATA box和ATG的杂合启动子.
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