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目的:在法医检案中可遇到非致命性机械性损伤如长时间限制体位、肢体被压迫后一段时间出现精神损伤甚至死亡的案件。由于此类损伤程度轻微,甚至没有明显的肉眼可见的外伤,因而此类案件的鉴定工作已经成为法医工作者面临的难题。分析此类案件的发生发展过程,不难发现这些案件均存在共同的特点即当事人产生不同程度的心理应激。研究已经证实,过度而持久的心理应激可以引起精神损伤,但具体的分子机制尚不明确。研究这一科学问题对于解决此类案件的鉴定工作具有非常重要的科学意义。应激是机体对各种应激原所作出一种适应性反应。其神经-内分泌反应主要表现为蓝斑-交感-肾上腺髓质系统和下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统的激活,使儿茶酚胺(catecholamine,CA)、糖皮质激素(glucocorticoid,GC)、胰高血糖素等应激相关激素的水平快速升高,来保证重要生命器官的功能和代谢,具有重要的防御代偿意义。但应激激素长时间维持高水平,可引起氧化应激、炎症、凋亡等多种病理过程,这使应激的防御代偿意义转变为对机体的损伤。CA是应激过程中发挥生物学效应的主要激素之一。研究CA对机体的损伤作用对于阐明应激性损害的机制具有重要意义。多巴胺(dopamine,DA)作为CA的一种,在脑内有着广泛的分布,是一种重要的神经递质,在调节运动、奖赏、学习、记忆以及情绪方面起着关键作用。越来越多的研究表明,多巴胺系统在应激引起的精神损伤中发挥重要作用,如精神分裂症、重性抑郁障碍等。因此研究多巴胺对中枢神经系统的损伤作用将为阐明心理应激导致精神损伤的机制提供理论依据。近年来,对于杏仁核的研究越来越多,并且逐渐意识到其在应激过程中可能也发挥着重要作用。杏仁核属于边缘系统的一部分,附着在海马的末端,与皮层、海马、下丘脑、脑干、嗅球等都有广泛的联系。杏仁核在恐惧、焦虑形成中发挥着重要作用,是对恐惧刺激做出反应的主要中枢。患有创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)的病人,杏仁核体积变小,并且在PTSD动物模型中,观察到杏仁核神经元损伤[5]。研究表明人杏仁核中有丰富的多巴胺D1和D2受体分布,在应激状态下杏仁核多巴胺释放增加,且多巴胺D1受体和多种神经心理疾病有关系。但对于多巴胺是否能引起杏仁核神经元凋亡目前尚不清楚。基于以上背景,本实验将在细胞水平探讨多巴胺是否可通过多巴胺D1受体诱导杏仁核神经元发生凋亡,从而为阐明心理应激导致精神障碍的机制提供一定实验依据。方法:1原代培养大鼠杏仁核神经元,应用免疫荧光细胞化学方法对神经元纯度进行鉴定。2通过MTS细胞增殖分析实验评价不同浓度多巴胺(10μM、30μM、50μM、100μM、150μM)对杏仁核神经元细胞存活率的影响,确定最佳浓度后,选取该浓度作用杏仁核神经元不同时间(24h、48h、72h),采用MTS实验评价不同作用时间对杏仁核神经元存活率的影响。3用DA处理杏仁核神经元后,免疫荧光细胞化学方法观察Bax蛋白转移情况,探讨DA处理后杏仁核神经元是否发生凋亡现象。4为了进一步证实DA是否导致了杏仁核神经元的凋亡,本实验采用DA(50μM)与DA1受体拮抗剂中文SCH-23390共同孵育神经元。实验分为四组:对照组、DA组、DA+SCH-23390组、SCH-23390组,作用48h后,用Real-time PCR技术检测各组促凋亡基因Bax m RNA的表达情况;采用TUNEL技术原位检测各组TUNEL阳性细胞率;采用Western blot技术比较各组ATF-6蛋白的表达水平情况。5数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法Tamhane’S T2作两两比较,以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1神经元原代培养结果:培养8-10天后,神经元胞体较小,胞核大而圆,突触细长、交织成网状,符合成熟神经元的特征。神经元胞体的特异性标记物MAP-2对神经元进行免疫荧光染色,结果显示原代培养神经元纯度≧90%,可用于后续实验。2多巴胺对杏仁核神经元存活率的影响(1)MTS筛选杏仁核神经元数量结果实验结果显示,杏仁核神经元数量与490nm处吸光度值呈线性相关,其相关性达R2=0.98916。为使MTS结果更准确,将吸光度值选取在0.8-0.9左右,此时96孔板选取细胞数为20000cells/well。(2)不同浓度DA对杏仁核神经元存活率的影响与对照组相比,50μM、100μM、150μM浓度的DA作用神经元48h后,杏仁核神经元存活率明显降低(P<0.05),且呈浓度依赖性;10μM、30μM的DA对神经元存活率没有明显影响(P>0.05)。因而将50μM作为DA导致杏仁核神经元存活率降低的最低敏感浓度进行时间依赖性检测。(3)DA作用不同时间(24h、48h、72h)对杏仁核神经元存活率的影响与对照组相比,50μM DA作用48h、72后,杏仁核神经元存活率明显降低(P<0.05);作用24h时,杏仁核神经元存活率没有明显变化(P>0.05)。因此选取50μM的DA作用于杏仁核神经元48h作为后续实验处理条件。3杏仁核神经元Bax蛋白转移情况结果:在DA处理后,通过免疫荧光细胞化学染色,观察到Bax蛋白转移至细胞核的现象,提示DA可能诱导杏仁核神经元凋亡的发生。4 RT-PCR检测杏仁核神经元Bax m RNA表达结果:与对照组相比,DA组Bax m RNA的表达水平明显增高(P<0.05);而DA+SCH-23390组相比于DA组,Bax m RNA的表达水平明显降低(P<0.05),说明DA可以诱导杏仁核神经元凋亡,且多巴胺D1受体参与了凋亡诱导过程。5 TUNEL检测杏仁核神经元凋亡结果与对照组相比,DA处理后,TUNEL阳性细胞率明显增加(P<0.05)。与DA组相比,用DA+SCH-23390共同处理后,TUNEL阳性细胞率明显降低(P<0.05),结合Bax m RNA表达的检测结果,进一步说明DA可以通过D1受体诱导杏仁核神经元凋亡。6 Western blot检测内质网跨膜蛋白ATF-6的表达结果与对照组比较,DA组ATF-6蛋白表达水平明显增高(P<0.05);与DA组相比,DA+SCH-23390组ATF-6蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。说明DA诱导杏仁核神经元的凋亡过程可能有内质网应激的参与。结论:多巴胺可以通过多巴胺D1受体诱导大鼠原代培养杏仁核神经元凋亡。