定点诱变是一种在目的基因中实现人为设计的突变技术,目前已广泛应用于蛋白质的定向进化,或者用于研究核酸及氨基酸序列与功能之间的相关性,进而筛选进化出具有更优良的特性的蛋白质,以此来满足生物医学、生物技术领域和工程酶产业的需求。尽管目前为止已经报道了一些成熟且应用广泛的建立突变体文库的方法,但难免会存在一些技术上的缺陷。最近,CRISPR/Cas9系统作为一种特异性的RNA引导的核酸酶,已经广泛应用于高效的基因组编辑,但是在体外的应用却很少报道。为了克服传统基于PCR诱变方法的缺陷,本文提出了一种高效并且实验操作简便的诱变方法,即in vitro CRISPR/Cas9-mediated mutagenic system(ICM)系统,首先在体外转录的特异性 sgRNA的引导下,利用编程酶CRISPR-Cas9对靶质粒进行酶切;然后利用T5核酸外切酶处理回收的载体,沿5’至3’方向外切,产生与引入突变的片段同源互补的15 nt黏性末端;最后,携带突变的引物互补退火并与经T5处理后的载体转化至大肠杆菌,从而得到重组的突变质粒。本实验研究课题的具体内容如下:1.CRISPR-Cas9蛋白的表达与纯化首先合成CRISPR-Cas9基因序列,克隆至pET-23a载体上;进而构建Cas9蛋白的表达质粒pET23a-Cas9,经转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)并挑取单菌落进行摇瓶培养;最后通过镍珠结合实验,并从菌液总蛋白中分离纯化Cas9,保存并用于后续酶切实验;2.ICM系统介导的定点突变为了验证ICM系统的可行性,首先尝试了将ICM系统应用于定点突变。以pET23a-GFP为靶质粒,利用ICM系统以高于95%的效率实现了 GFP基因的单点定点突变;然后成功实现了将ICM系统应用于GFP基因的双点突变;接着,以PDM1-H3为靶质粒,实现一步法高效地构建出HHT2基因三个相近位点的三个突变体;以pPIC9K-PAT4为靶质粒,以高达80%的效率地实现了9.5 kb大质粒的定点突变,结果显示80%(8/10)的测序样品属于理想突变体,表明ICM系统同样适用于大质粒的诱变,并且克服了传统方法无法扩增大片段的缺陷;3.ICM系统介导的定点饱和突变除了定点诱变,本研究同样尝试了将ICM系统应用于定点饱和突变。同样首先以pET23a-GFP为靶质粒,采用NNK密码子引物构建单点的饱和突变体库,基于ICM和PCR方法同时做平行实验,结果表明基于ICM的方法构建的突变体库具有更高的样品多样性;接着采用NNN密码子构建双点的饱和突变体库,结果同样表明ICM系统与PCR方法相比,在核苷酸和氨基酸的低偏爱性方面具有很强的优势;最后以pET22b-LEH为靶质粒,通过对突变氨基酸的三联体密码子进行半理性设计,成功构建出四个位点的组合饱和突变体库,氨基酸表型的分布比例也符合预期,没有明显的偏爱性;4.ICM系统在研究蛋白序列与功能之间的联系上的应用为了将ICM系统应用于实际,以LY338-SUMO为靶质粒,选取SUMO标签后面的GGN(SUMO蛋白酶酶切位点,N代表除丝氨酸以外的19种氨基酸)为突变位点,成功获得19种突变体并展示酿酒酵母细胞表面,用流式细胞仪分析并验证酶切位点氨基酸对SUMO蛋白酶酶切效率的影响。本文中ICM系统已成功并且高效地实现了单点和多点的定点突变和定点饱和突变,与传统方法相比,除了具有高效率以外,具有更广泛的适用性和简便可控的操作性,因此有利于促进合成生物学方向的研究。