论文部分内容阅读
基质金属蛋白酶12（Matrix metalloproteinase 12,MMP12）是基质金属蛋白酶家族（Matrix metalloproteinases,MMPs）的成员之一,在正常生理条件下,可以维持细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）的正常结构和功能,在细胞外基质的降解和重构等方面发挥着重要的作用。近年来多项研究结果表明,MMP12参与炎症、心血管疾病和肿瘤发生等病理过程。因此,研究MMP12表达调控机制将为其功能研究及相关疾病的治疗提供新的思路和有力的科学依据。CRISPR/Cas9基因编辑技术为靶向基因组编辑提供了一种简便、高效的方法,可以在真核细胞中实现高度灵活和特异的基因组编辑,目前已经广泛用于基因功能的研究。为了研究MMP12基因的转录调控及其功能,本课题在HEK293细胞系中,利用CRISPR/Cas9技术将荧光素酶（luciferase）报告基因定点整合到MMP12基因下游,经过正负药筛以及有限稀释法克隆化后,对细胞系进行基因型检测及测序鉴定,证实了 HEK293细胞系中外源荧光素酶报告基因的定点插入,成功构建了受内源性MMP12基因启动子调控荧光素酶活性的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI 细胞系。为了验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的可靠性,我们首先选择了可能对MMP12有激活作用的三个转录因子STAT3、AP-1、SP-1分别转染该细胞系,对细胞系中luciferase的表达活性进行检测,并将三个转录因子转染HEK293细胞,通过检测MMP12基因的mRNA表达加以验证,结果显示,HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中luciferase的表达与野生型HEK293细胞系中mRNA的表达趋势一致,表明HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中荧光素酶的表达能准确反映内源性MMP12基因启动子活性,证明了实验方法的可行性和所构建细胞系的可靠性;接下来,我们利用构建好的细胞系进行了与炎症相关的小分子药物筛选,通过luciferase活性检测,发现一种小分子药物Tanshinone I可以抑制MMP12基因的表达,与Tanshinone I处理后的HEK293细胞系中MMP12的mRNA表达趋势一致,这进一步证明了 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的可靠性,与此同时,筛选出的小分子药物为研究以MMP12为治疗靶点的潜在药物开发提供了新的思路。因此,这一新型细胞系的构建将有助于研究MMP12基因的转录调控及其生物功能,在筛选作用于MMP12基因的转录因子和小分子药物方面具有较大的潜力。本课题的具体实验流程和研究内容分为以下几个部分:1.打靶载体的构建:为了构建打靶载体,我们在sgRNA在线设计网站（http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp）设计并选择了四个针对 MMP12 基因终止子下游区域的sgRNA,每个sgRNA被克隆到pU6/sgRNA1.0载体,并利用T7E1对四个sgRNA1-4分别进行生物活性检测,选择生物活性最高的sgRNA3,连入载体 pUC19/CMV-Cas9,获得打靶载体 pUC19/CMV-Cas9-U6-MMP12 sgRNA3。2.靶向MMP12基因的供体载体的构建:在NCBI查找获知MMP12基因序列,将PCR获得的针对MMP12打靶区域的上游、下游同源臂,分步连入实验室现有的载体,成功构建了靶向MMP12基因的供体载体。其中上游同源臂后连着 T2A-luciferase 元件和正筛元件 CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA,然后是下游同源臂以及紧随其后的负筛元件PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA。由于供体载体含有报告基因和正、负筛元件,因此可以通过直接观察eGFP及mCherry的表达区分随机整合细胞和同源重组细胞,通过TK自杀基因能剔除随机整合的细胞,通过Neomycin筛选基因能富集同源重组成功的细胞,从而有效提升同源重组细胞的占比。3.HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的构建及鉴定:首先,将打靶载体pUC 19/CMV-Cas9-U6-MMP 12 sgRNA3 和供体载体用脂质体法共转染HEK293细胞,通过药物G418和GCV分别进行正、负筛选后,将生长稳定的细胞进行有限稀释法克隆化。然后,对获得的多个单克隆细胞系进行luciferase活性检测,选择luciferase表达活性较高的几个单克隆细胞系提基因组,通过PCR进行外源基因定点插入检测。最后,选择PC.R鉴定阳性的单克隆细胞进行进一步测序检测,成功获得外源基因定点整合的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI 细胞系。4.筛选激活MMP12基因表达的转录因子:通过查阅文献及网站预测,我们选择三个对MMP12有激活作用的转录因子STAT3、AP-1和SP-1分别连入真核表达载体 pUC19/CMV 后,分别转染 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系,空白质粒作为对照。研究结果显示,与对照组相比,经STAT3、AP-1或SP-1表达载体处理的细胞系luciferase活性增加,说明STAT3、AP-1或SP-1转录因子上调了 MMP12的转录活性。同时,将这三种转录因子分别转染野生型HEK293细胞,通过Real-time PCR检测MMP12的mRNA表达,结果表明三种转录因子均促进MMP12基因的表达。上述结果表明,我们已经成功构建了 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI 细胞系,该细胞系 luciferase的表达与内源性MMP12基因启动子的转录活性具有良好的相关性。通过对该细胞系进行luciferase活性检测,便可直观、快捷的获知内源性MMP12的表达水平,因此,该细胞系可用于MMP12基因转录调控和生物学功能研究。5.筛选抑制MMP12基因表达的小分子药物:多项研究表明,在肿瘤发生、心血管疾病、肺气肿、哮喘、炎症等相关疾病中,MMP12的表达上调,因此,MMP12可作为相关疾病的临床药物潜在治疗靶点。本课题利用购买的炎症相关的小分子药库在HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中筛选抑制MMP12表达的小分子药物。在本次筛选中,我们通过检测luciferase活性发现Tanshinone I可以显著抑制MMP12基因的转录活性。用Tanshinone I处理野生型HEK293细胞系,利用Real-time PCR对MMP12基因的mRNA表达水平进行检测,结果显示,Tanshinone I可抑制MMP12的表达,进一步验证了 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的可靠性。同时,筛选获得的小分子药物Tanshinone I可作为潜在的MMP12靶向药物。上述研究表明,本课题构建的新型细胞系为靶向抑制MMP12基因的小分子药物筛选提供有力工具。综上所述,本课题取得以下结果:（1）利用CRISPR/Cas9技术成功构建了通过luciferase表达水平直观反映内源性MMP12基因表达水平的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系,并通过PCR及测序检测证明了荧光素酶报告基因在MMP12基因终止子下游打靶区域进行了精确的定点整合;（2）利用HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系成功筛选了可激活MMP12基因转录的转录因子,为MMP12基因转录调控活性和功能的研究奠定基础;（3）利用HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系成功筛选了抑制MMP12基因表达的小分子药物Tanshinone I,为开发新的MMP12靶向药物提供了有效手段。上述实验结果表明,本课题成功构建了 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系,该细胞系在筛选作用于MMP12基因的转录因子和小分子药物方面提供了有效的技术工具,为研究MMP12基因的功能提供新的思路。