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目的:
Leber先天性黑矇(Lebercongenitalamaurosis,LCA)是发病最早、最严重的遗传性视网膜疾病,该病具有遗传和临床异质性,人口发病频率在1/30,000和1/81,000之间,占所有遗传性视网膜病的5%。患者表现为出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失,其临床特征表现为严重视力损害或失明,眼球震颤,眼球追踪功能严重损害甚至缺失,以及视网膜电图(ERG)波峰值严重降低或缺失。由于LCA发病机制复杂且没有完美的疾病模型,因此,本研究旨在利用LCA患者体细胞来源的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)体外分化三维视网膜类器官,构建视网膜类器官的疾病模型,探讨该病的发生发展过程及机制,为今后的疾病治疗、药物筛选以及视网膜移植提供新的思路。
方法:
通过体外分离并培养患者及其健康母亲外周静脉血中的单个核细胞,并利用非整合型混合质粒电转,重编程为iPSCs;对LCA患者及健康者的iPSCs进行染色体核型分析及多能性鉴定,并在体外进行三维(3D)视网膜分化;利用免疫荧光染色、RNA-seq、TUNEL细胞凋亡检测等技术对LCA患者及健康母亲特异性的视网膜类器官进行表型分析、基因及蛋白表达特征的检测、感光细胞渐进性死亡的检测;初步探索LCA病人发病过程及分子机制。
结果:
通过体外成功分离、扩增培养LCA患者及其健康母亲外周静脉血中的单个核细胞,并重编程为iPSCs。染色体核型分析显示所有iPSCs均为正常核型,免疫荧光染色显示所有iPSCs均高表达OCT4,SSEA4,SOX2多能性标志物,且具有向三个胚层分化的能力;通过对分化的3D视网膜类器官进行形态结构分析发现,分化第60天时,LCA病人的神经视网膜(neuralretina,NR)层中开始出现玫瑰花团样(rosette)结构,且LCA病人的NR层比健康母亲的厚;免疫荧光染色显示,第75、90天病人类器官表达BRN3B,OTX2,PAX6等阳性细胞的数量及分布与其健康母亲相比有显著差异,第105天病人表达CRX,RCVRN的阳性细胞数量及分布明显与健康母亲不同,且在第165天可见病人表达视蛋白(L/M-opsin,S-opsin)的视锥细胞数明显少于健康母亲,未发现表达视紫红质(Rhodopsin)的视杆细胞;TUNEL细胞凋亡染色结果提示在第75天后,病人NR中凋亡细胞比其健康母亲显著增多;RNA-seq分析结果发现病人的视网膜发育相关基因NRL,NR2E3等均有下调。
结论:
本课题成功利用LCA病人的外周血单个核细胞构建了病人特异性的iPSCs,并对其进行视网膜类器官的分化,建立了LCA的疾病模型。利用该疾病模型,我们模拟了LCA病人的视网膜发育及病发过程,初步揭示了LCA的发病分子机制。为今后探索LCA基因的干预治疗及LCA发生发展的具体机制做了铺垫,也为LCA病人的早期诊断和精准化治疗提供关键的科学依据。
Leber先天性黑矇(Lebercongenitalamaurosis,LCA)是发病最早、最严重的遗传性视网膜疾病,该病具有遗传和临床异质性,人口发病频率在1/30,000和1/81,000之间,占所有遗传性视网膜病的5%。患者表现为出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失,其临床特征表现为严重视力损害或失明,眼球震颤,眼球追踪功能严重损害甚至缺失,以及视网膜电图(ERG)波峰值严重降低或缺失。由于LCA发病机制复杂且没有完美的疾病模型,因此,本研究旨在利用LCA患者体细胞来源的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)体外分化三维视网膜类器官,构建视网膜类器官的疾病模型,探讨该病的发生发展过程及机制,为今后的疾病治疗、药物筛选以及视网膜移植提供新的思路。
方法:
通过体外分离并培养患者及其健康母亲外周静脉血中的单个核细胞,并利用非整合型混合质粒电转,重编程为iPSCs;对LCA患者及健康者的iPSCs进行染色体核型分析及多能性鉴定,并在体外进行三维(3D)视网膜分化;利用免疫荧光染色、RNA-seq、TUNEL细胞凋亡检测等技术对LCA患者及健康母亲特异性的视网膜类器官进行表型分析、基因及蛋白表达特征的检测、感光细胞渐进性死亡的检测;初步探索LCA病人发病过程及分子机制。
结果:
通过体外成功分离、扩增培养LCA患者及其健康母亲外周静脉血中的单个核细胞,并重编程为iPSCs。染色体核型分析显示所有iPSCs均为正常核型,免疫荧光染色显示所有iPSCs均高表达OCT4,SSEA4,SOX2多能性标志物,且具有向三个胚层分化的能力;通过对分化的3D视网膜类器官进行形态结构分析发现,分化第60天时,LCA病人的神经视网膜(neuralretina,NR)层中开始出现玫瑰花团样(rosette)结构,且LCA病人的NR层比健康母亲的厚;免疫荧光染色显示,第75、90天病人类器官表达BRN3B,OTX2,PAX6等阳性细胞的数量及分布与其健康母亲相比有显著差异,第105天病人表达CRX,RCVRN的阳性细胞数量及分布明显与健康母亲不同,且在第165天可见病人表达视蛋白(L/M-opsin,S-opsin)的视锥细胞数明显少于健康母亲,未发现表达视紫红质(Rhodopsin)的视杆细胞;TUNEL细胞凋亡染色结果提示在第75天后,病人NR中凋亡细胞比其健康母亲显著增多;RNA-seq分析结果发现病人的视网膜发育相关基因NRL,NR2E3等均有下调。
结论:
本课题成功利用LCA病人的外周血单个核细胞构建了病人特异性的iPSCs,并对其进行视网膜类器官的分化,建立了LCA的疾病模型。利用该疾病模型,我们模拟了LCA病人的视网膜发育及病发过程,初步揭示了LCA的发病分子机制。为今后探索LCA基因的干预治疗及LCA发生发展的具体机制做了铺垫,也为LCA病人的早期诊断和精准化治疗提供关键的科学依据。