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目的:小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associatedtranscriptionfactor,MITF)在RPE(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞中发挥重要功能。Mitf基因功能缺陷将导致严重的RPE缺陷相关的视网膜变性、小眼畸形以及毛发色白,但是目前对于MITF如何导致RPE细胞的功能异常及其相关分子机制尚不完全清楚。鉴于RPE细胞的吞噬作用是RPE细胞重要的功能之一,本研究旨在解析MITF在RPE细胞吞噬中的功能,研究RPE细胞吞噬功能异常与视网膜病变的内在联系并探讨其可能机理,为该类疾病的转化医学研究提供理论基础和实验支持。
方法:利用野生型(WT)、Mitf基因敲除杂合子(Mitf-/+)以及Mitf基因敲除纯合子(Mitf-/-)小鼠,结合ERG功能检测、苏木精伊红染色、油红O染色、眼底拍照、吞噬能力检测,分析体内Mitf基因下调或缺失后对RPE吞噬能力的影响。同时,为了解析MITF调控RPE吞噬作用的分子机制,利用RNA-sequencing比较WT与Mitf-/+小鼠RPE细胞mRNA表达谱差异,分析MITF影响RPE细胞吞噬的潜在靶基因,并通过RT-PCR和westernblotting进行验证。
结果:利用ERG功能检测,发现2月龄的Mitf-/+小鼠也存在着视功能障碍。利用吞噬能力检测实验,发现相对于WT小鼠,2月龄的Mitf-/+小鼠表现出RPE吞噬功能障碍。同样的P10的Mitf-/-小鼠也存在RPE吞噬能力异常。通过眼底拍照发现12月龄杂合子小鼠存在异常黄色斑块,而对应的野生型均未发现。油红O染色显示RPE层存在脂质的堆积。上述结果都表明RPE的吞噬能力异常。利用RNA-sequencing分析,发现相对于WT的RPE,Mitf-/+小鼠的RPE中大量与溶酶体相关基因的表达发生了显著变化,其中着重关注了β-甘露糖苷酶。利用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法证明在MITF表达下调导致β-甘露糖苷酶的mRNA以及蛋白水平均显著下调。
结论:综上所述,本研究证明MITF在RPE细胞的吞噬能力中发挥重要作用。Mitf表达下调导致视功能障碍,Mitf功能缺陷小鼠RPE细胞出现明显的吞噬功能异常,其潜在的作用机制之一可能是MITF通过调控溶酶体相关基因(如β-甘露糖苷酶)的表达来影响溶酶体的功能,从而调节RPE的吞噬能力。本论文研究将为后续深入解析MITF功能缺陷在RPE细胞功能障碍以及相关的视网膜变性疾病发生中的作用提供了新的思路和实验依据。
方法:利用野生型(WT)、Mitf基因敲除杂合子(Mitf-/+)以及Mitf基因敲除纯合子(Mitf-/-)小鼠,结合ERG功能检测、苏木精伊红染色、油红O染色、眼底拍照、吞噬能力检测,分析体内Mitf基因下调或缺失后对RPE吞噬能力的影响。同时,为了解析MITF调控RPE吞噬作用的分子机制,利用RNA-sequencing比较WT与Mitf-/+小鼠RPE细胞mRNA表达谱差异,分析MITF影响RPE细胞吞噬的潜在靶基因,并通过RT-PCR和westernblotting进行验证。
结果:利用ERG功能检测,发现2月龄的Mitf-/+小鼠也存在着视功能障碍。利用吞噬能力检测实验,发现相对于WT小鼠,2月龄的Mitf-/+小鼠表现出RPE吞噬功能障碍。同样的P10的Mitf-/-小鼠也存在RPE吞噬能力异常。通过眼底拍照发现12月龄杂合子小鼠存在异常黄色斑块,而对应的野生型均未发现。油红O染色显示RPE层存在脂质的堆积。上述结果都表明RPE的吞噬能力异常。利用RNA-sequencing分析,发现相对于WT的RPE,Mitf-/+小鼠的RPE中大量与溶酶体相关基因的表达发生了显著变化,其中着重关注了β-甘露糖苷酶。利用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法证明在MITF表达下调导致β-甘露糖苷酶的mRNA以及蛋白水平均显著下调。
结论:综上所述,本研究证明MITF在RPE细胞的吞噬能力中发挥重要作用。Mitf表达下调导致视功能障碍,Mitf功能缺陷小鼠RPE细胞出现明显的吞噬功能异常,其潜在的作用机制之一可能是MITF通过调控溶酶体相关基因(如β-甘露糖苷酶)的表达来影响溶酶体的功能,从而调节RPE的吞噬能力。本论文研究将为后续深入解析MITF功能缺陷在RPE细胞功能障碍以及相关的视网膜变性疾病发生中的作用提供了新的思路和实验依据。