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目的
视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)是视网膜最外层的单细胞层状结构,其位于光感受器细胞外节与Bruch膜之间,为血-视网膜屏障的重要组成部分。RPE为光感受器细胞提供营养物质和氧气的同时吞噬掉光感受器细胞代谢产生的外节结构,并参与视黄醛的再生循环,对维持光感受器细胞功能起着至关重要的作用。RPE细胞会向基底方向分泌血管内皮生长因子(VEGF),起到维持脉络膜血管正常功能的作用。在顶部方向,RPE细胞分泌色素上皮衍生因子(PEDF)和转化生长因子β(TGF-β),发挥复杂而多样化的作用,其中包括调控免疫反应。目前视网膜不可逆性退行性疾病(包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病和Usher综合征等)在临床上缺乏有效的治疗手段,利用多能干细胞分化RPE进行移植治疗具有广阔的应用前景。已有的研究表明多能干细胞分化来源的RPE细胞在临床上治疗黄斑变性病人能减缓疾病的发展,取得了明显效果。胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)由于来源于早期胚胎,存在伦理和免疫排斥问题,而诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)存在外源性基因整合的安全性问题。因此,建立更加安全且适于临床应用的新型多能干细胞来源的RPE细胞显得尤为重要。本实验中我们在不引入外源基因的前提下,只使用小分子化合物将小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEFs)重编程为化学诱导多能干细胞(chemicalinducedpluripotentstemcells,CiPSCs),再利用小分子化合物将CiPSCs诱导分化为RPE样细胞。
方法
1.酶消化法分离孕期13.5天小鼠胚胎成纤维细胞,用成纤维细胞培养基进行培养扩增和冻存。
2.将MEFs按5×104/孔接种于6孔板中,24h后换成小分子化合物组合VC6TFAE培养基诱导,16天传代后换成VC6TFASD培养,28天后换成N2B27-2iL培养,40天后将克隆挑出纯化得到CiPSCs。
3.免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR)、畸胎瘤等实验验证CiPSCs多能性。
4.利用三维培养转二维培养的方法,小分子化合物诱导培养基将CiPSCs分化为RPE样细胞。
5.免疫荧光染色、qRT-PCR、吞噬等实验,验证分化得到的RPE细胞的生物学特征及功能。
结果
1.分离得到小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。
2.利用小分子化合物组合诱导培养40天,成功将MEFs重编程为CiPSCs。
3.检测结果证明CiPSCs表达多能性相关标志物和具有向三胚层分化的能力。
4.运用小分子化合物结合三维培养转二维培养的方法,CiPSCs成功分化出具有六边形和大量黑色素的RPE细胞。
5.RPE分化过程中细胞视网膜早期的标志物PAX6、OTX2和RPE标志物ZO-1的表达。qRT-PCR实验进一步说明RPE相关的基因如Rpe65、Mitf、Cralbp、Tyr、Otx2、Best1等基因表达明显上调。吞噬实验证明RPE细胞具有吞噬功能。
结论
本实验成功利用小分子化合物将MEFs重编程为CiPSCs。CiPSCs分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的生物学特性。我们建立了从胚胎成纤维细胞到CiPSCs,再到RPE细胞的诱导分化体系,整个过程无外源性基因导入,得到的RPE细胞不存在伦理争议也更安全,为RPE细胞移植治疗提供更优质的细胞来源。
视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)是视网膜最外层的单细胞层状结构,其位于光感受器细胞外节与Bruch膜之间,为血-视网膜屏障的重要组成部分。RPE为光感受器细胞提供营养物质和氧气的同时吞噬掉光感受器细胞代谢产生的外节结构,并参与视黄醛的再生循环,对维持光感受器细胞功能起着至关重要的作用。RPE细胞会向基底方向分泌血管内皮生长因子(VEGF),起到维持脉络膜血管正常功能的作用。在顶部方向,RPE细胞分泌色素上皮衍生因子(PEDF)和转化生长因子β(TGF-β),发挥复杂而多样化的作用,其中包括调控免疫反应。目前视网膜不可逆性退行性疾病(包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病和Usher综合征等)在临床上缺乏有效的治疗手段,利用多能干细胞分化RPE进行移植治疗具有广阔的应用前景。已有的研究表明多能干细胞分化来源的RPE细胞在临床上治疗黄斑变性病人能减缓疾病的发展,取得了明显效果。胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)由于来源于早期胚胎,存在伦理和免疫排斥问题,而诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)存在外源性基因整合的安全性问题。因此,建立更加安全且适于临床应用的新型多能干细胞来源的RPE细胞显得尤为重要。本实验中我们在不引入外源基因的前提下,只使用小分子化合物将小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEFs)重编程为化学诱导多能干细胞(chemicalinducedpluripotentstemcells,CiPSCs),再利用小分子化合物将CiPSCs诱导分化为RPE样细胞。
方法
1.酶消化法分离孕期13.5天小鼠胚胎成纤维细胞,用成纤维细胞培养基进行培养扩增和冻存。
2.将MEFs按5×104/孔接种于6孔板中,24h后换成小分子化合物组合VC6TFAE培养基诱导,16天传代后换成VC6TFASD培养,28天后换成N2B27-2iL培养,40天后将克隆挑出纯化得到CiPSCs。
3.免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR)、畸胎瘤等实验验证CiPSCs多能性。
4.利用三维培养转二维培养的方法,小分子化合物诱导培养基将CiPSCs分化为RPE样细胞。
5.免疫荧光染色、qRT-PCR、吞噬等实验,验证分化得到的RPE细胞的生物学特征及功能。
结果
1.分离得到小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。
2.利用小分子化合物组合诱导培养40天,成功将MEFs重编程为CiPSCs。
3.检测结果证明CiPSCs表达多能性相关标志物和具有向三胚层分化的能力。
4.运用小分子化合物结合三维培养转二维培养的方法,CiPSCs成功分化出具有六边形和大量黑色素的RPE细胞。
5.RPE分化过程中细胞视网膜早期的标志物PAX6、OTX2和RPE标志物ZO-1的表达。qRT-PCR实验进一步说明RPE相关的基因如Rpe65、Mitf、Cralbp、Tyr、Otx2、Best1等基因表达明显上调。吞噬实验证明RPE细胞具有吞噬功能。
结论
本实验成功利用小分子化合物将MEFs重编程为CiPSCs。CiPSCs分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的生物学特性。我们建立了从胚胎成纤维细胞到CiPSCs,再到RPE细胞的诱导分化体系,整个过程无外源性基因导入,得到的RPE细胞不存在伦理争议也更安全,为RPE细胞移植治疗提供更优质的细胞来源。