背景:须癣毛癣菌是一种亲人、亲动物性皮肤癣菌,是世界范围内第二大常见的皮肤致病癣菌,在某些地区发病率极高,位居第一。在大多数情况下头皮、光滑皮肤、指甲等表浅组织是须癣毛癣菌的易感染部位,在极少数情况下出现须癣毛癣菌深部组织感染。但是近年来,随着人们饲养宠物的盛行,须癣毛癣菌引起深部感染的发病率逐年攀升。由于须癣毛癣菌深部感染临床少见,症状不典型,易发生误诊漏诊,正确诊疗的延迟使得患者出现瘢痕、秃发及继发感染引起的疼痛等危害,且须癣毛癣菌深部感染治疗时间长、容易反复感染,对人类健康影响颇大。而目前其发病机制尚不清楚,传统诊断主要通过刮取皮损皮屑、脓液或者活检组织进行真菌直接镜检或者培养,并结合皮损组织的病理检查来明确,所需时间较长,因此明确须癣毛癣菌深部感染的发病机制以及建立快速诊断的方法意义重大。在前期实验中我们通过比较须癣毛癣菌肉芽肿菌株与体癣菌株蛋白表达的不同,得出烯醇化酶在肉芽肿株高表达,推测烯醇化酶可能是须癣毛癣菌深部感染的致病因子。目前尚无有关须癣毛癣菌烯醇化酶的相关研究。有关白念珠菌、酿酒酵母、黄曲霉等真菌的烯醇化酶研究较为透彻,其研究数据得知烯醇化酶又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶,在真菌的细胞质中大量普遍存在,具有高度保守的特性,在生物体糖酵解中作为胞内酶存在,是催化2-磷酸-甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转化的必不可少的物质。在白念珠菌感染浅表组织时烯醇化酶并不表达,仅仅在深部感染时才会释放,因此我们推测须癣毛癣菌产生的烯醇化酶可能是深部感染的关键酶或重要的毒力因子;由于白念珠菌产生的烯醇化酶具有很强的抗原性,能够刺激机体产生细胞和体液免疫反应,故我们推测须癣毛癣菌在深部感染中产生的烯醇化酶也具有抗原性,刺激机体产生抗烯醇化酶抗体。假如上述两个推测成立,那么烯醇化酶作为一抗原可作为须癣毛癣菌早期诊断的一个指标。为验证上述推测,前期通过大量实验已经成功获取须癣毛癣菌烯醇化酶基因全长cDNA序列,制备了须癣毛癣菌烯醇化酶重组蛋白抗原。目的:制备抗须癣毛癣菌烯醇化酶单克隆抗体。方法:1.将前期制备的含pET-16b-ENO的菌液接种于氨苄抗性LB培养基中诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳分析,蛋白经PBS透析过夜,分装保存;2.将纯化好的烯醇化酶重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠;3.取血清抗体效价达标的小鼠脾细胞与髓瘤细胞在聚乙二醇的诱导下在体外进行细胞融合;4.ELISA法测定上清效价,筛选阳性细胞株。5.有限稀释法对筛选的阳性细胞株进行亚克隆,筛选、建株;6.筛选出阳性的杂交瘤细胞株制备腹水,亲和层析法纯化腹水,获得单克隆抗体;7.间接ELISA Western blot法对单克隆抗体对进行效价及特异性检测。结果:1.诱导表达纯化后的蛋白经SAS-PAGE分析鉴定为目的蛋白,且具有较高的纯度;2.融合前取脾的小鼠免疫血清效价为1:32000,经两次细胞融合,所得的细胞融合率分别为63.75%和55.62%,阳性率分别为5.22%和4.87%;3.获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E7、3H4,间接ELISA效价检测结果分别为1:32000和1:64000,并通过Western blot验证了其特异性。结论:1.本实验成功获得了能稳定分泌须癣毛癣菌烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株;2.制备出了须癣毛癣菌烯醇化酶单克隆抗体,并进行初步鉴定。