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第一部分 KGF通过整合素促进口腔黏膜上皮黏附及钉突延长目的:口腔黏膜上皮与固有层的黏附是口腔黏膜发挥抵抗细菌入侵、防止体液流失等生理功能的基础条件。上皮钉突能扩大口腔黏膜上皮层与固有层之间的黏附面积,从而促进上皮层的黏附,而整合素（integrin）是介导上皮细胞与基底膜黏附的重要分子。角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）既可促进皮肤上皮钉突的延长,又能提升包括皮肤角质形成细胞在内的多种类型细胞表面整合素分子的表达。因此,本部分的研究目的是探讨KGF对口腔黏膜上皮黏附以及钉突延长的影响,并进一步分析整合素和上皮钉突在口腔黏膜上皮黏附中的作用。方法:于大鼠舌腹黏膜下分别注射PBS,KGF（400 ng/mL）,HYD-1（整合素拮抗剂,4mg/mL）,以及KGF+HYD-1。应用NaCl脱上皮法处理各组口腔黏膜标本,利用氰基丙烯酸乙酯胶水将黏膜上皮层与测力计粘在一起,然后应用测力计测量上皮与固有层之间的黏附力。应用Spot测量软件测量上皮钉突的长度（从钉突的基底部到尖端的垂直距离）。体外黏附实验分析KGF、整合素拮抗剂对口腔黏膜上皮细胞系HIOEC（human immortalized oral epithelial cell）黏附的影响,同时应用3D培养系统分析KGF以及整合素拮抗剂对HIOEC迁移的影响。通过免疫组织化学染色及其分析软件（Image Proplus）检测KGF、KGFR以及整合素α6、β4、α3、β1亚基在人咀嚼黏膜、衬里黏膜以及大鼠舌腹黏膜上皮中的表达,最后分析体内KGF、整合素表达水平与黏膜上皮层黏附力之间的相关性。结果:黏膜下注射KGF可以提升口腔黏膜上皮层与固有层之间的黏附力,延长上皮钉突的长度,增加黏膜上皮基底层细胞表面KGFR和整合素的表达水平。整合素拮抗剂HYD-1可显著抑制KGF诱导的黏膜上皮黏附力增加和钉突延长。体外实验证明,KGF促进2D和3D培养环境下HIOEC细胞表面整合素α6、β4、α3、β1亚基的表达。细胞黏附实验表明HYD-1抑制HIOEC细胞在人工基底膜（Mαtrigel）的黏附。本研究还发现在钉突较长的人咀嚼黏膜中,KGF、KGFR以及整合素α6、β4、α3、β1亚基的表达水平显著高于钉突较短的衬里黏膜中的表达水平。进一步的相关性分析提示人口腔黏膜上皮钉突的长度与KGF、KGFR以及整合素α6、β4、α3、β1亚基的表达水平正相关。结论:KGF通过整合素促进口腔黏膜上皮黏附及钉突延长,提示整合素在口腔黏膜上皮黏附中的独特作用。第二部分KGF诱导口腔黏膜上皮细胞伪足小体的形成目的:KGF可以通过整合素促进口腔黏膜上皮黏附和钉突延长,该过程涉及半桥粒的解聚、上皮细胞迁移以及基底膜的重塑。因此,可能会降低黏膜上皮层与固有层之间的黏附强度。但事实上,KGF处理大鼠口腔黏膜,其上皮层的黏附力非但不降、反生增加。伪足小体（podosome）是一种介导细胞-基质黏附的重要结构,富含整合素及金属基质蛋白酶,因此具备黏附和基质降解功能。本部分的研究目的在于探讨KGF处理HIOEC细胞后伪足小体形成的可能性。方法:体外培养HIOEC,并给予KGF（10ng/ml）处理,首先利用共聚焦激光扫描显微镜观察HIOEC细胞中F-肌动蛋白（F-actin）与皮动蛋白（cortactin）的共定位。然后,观察整合素α6、β4、α3、β1亚基以及金属基质蛋白酶14（MMP14）在F-肌动蛋白周围的分布情况。最后基质降解实验分析KGF处理后,HIOEC细胞降解细胞外基质（Matrigel）能力。结果:在KGF诱导下,HIOEC细胞可形成F-肌动蛋白/皮动蛋白复合体（伪足小体）,F-肌动蛋白周围富含整合素α6、β4、α3、β1亚基以及MMP14。基质降解实验证实该结构具有基质降解能力。结论:KGF诱导HIOEC细胞中伪足小体的形成,这可能是KGF促进口腔黏膜上皮钉突延长的机制之一。第三部分Integrin-Erk1/2信号通路在KGF诱导HIOEC伪足小体形成中的作用目的:上述部分已经证实KGF可以诱导HIOEC细胞中伪足小体的形成。整合素不仅是伪足小体的重要组成成分,而且在伪足小体的形成过程中发挥重要的调控作用。本部分旨在研究整合素在KGF诱导HIOEC细胞伪足小体形成过程中的调控作用。方法:预先使用HYD-1拮抗剂或者整合素α6、β4、α3、β1亚基的特异性功能中和性抗体处理HIOEC细胞,后行KGF诱导,利用共聚焦激光扫描显微镜观察HIOEC细胞中伪足小体的形成能力。分析整合素及其介导的信号转导在KGF诱导的伪足小体形成中的作用。蛋白质印迹（Western blot,WB）检测 KGF 处理 HIOEC 后 MAPK,Akt,Jak-Stat信号通路中关键信号分子的磷酸化水平,以此筛选出介导KGF对HIOEC发挥作用的信号分子。利用Erk1/2和Akt的抑制剂U0126和Ly294002处理HIOEC细胞,共聚焦激光扫描显微镜观测其对KGF诱导HIOEC中伪足小体形成的影响,MTT和EdU实验分析Erk1/2和Akt对HIOEC增殖的影响。利用特异性siRNA敲低整合素的表达,分析其对Erk1/2和Akt磷酸化水平的影响。结果:整合素拮抗剂HYD-1显著抑制KGF诱导的HIOEC细胞中伪足小体的形成。整合素β4、β1亚基的特异性中和性抗体可显著抑制KGF诱导的HIOEC细胞中伪足小体的形成,而整合素α6、α3亚基的中和性抗体对此无影响。蛋白质印记技术检测发现KGF处理HIOEC后Erk1/2和Akt的磷酸化水平显著提高。Erk1/2抑制剂U0126可显著抑制KGF诱导的HIOEC细胞中伪足小体的形成,但是Akt抑制剂Ly294002处理HIOEC细胞对伪足小体形成无影响。敲除整合素β4、β1均可降低Erk1/2和Akt的磷酸化水平。结论:Integrin-Erk1/2信号通路在KGF诱导HIOEC细胞伪足小体形成过程中发挥关键作用,且整合素β4、β1二者缺一不可。