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肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤的发生、复发和转移中起着重要作用。到目前为止,还没有发现针对CSCs的特异性药物,因为CSCs对大多数传统疗法都有耐药性,并且无限期增殖。三阴性乳腺癌是一种难以治疗而且特殊的乳腺癌亚型,缺乏针对三阴性乳腺癌的有效靶向疗法与富集肿瘤干细胞群和耐药密切相关。本课题研究,我们通过磁激活细胞分选法从MDA-MB-231和HCC1806细胞中富集了CD44+/CD24-乳腺癌干细胞,并将其在无血清培养基中培养。本研究的目的是评价从白钻（S.viridis A.C.Smith）中分离得到的Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌细胞的抑制作用,并通过体内外细胞凋亡的方法靶向MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌干细胞。首先,我们研究了白钻衍生出来的天然化合物的抗增殖活性。我们用11种化合物对两株人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC1806给药两天,并用Alamar blue测定法测量了细胞活力。Gomisin M2被认为是从白钻提取的11种化合物中最有效的细胞毒性化合物。我们发现Gomisin M2以剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞活力,并以时间依赖的方式减小3D球体形成的大小。Gomisin M2对两种三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,IC50=60μM;HCC1806,IC50=57μM)最具细胞毒性。我们根据BCSCs标志物通过磁激活细胞分选（MACS）对癌症干细胞进行了分选。我们使用MACS从正常癌细胞中分离出CD44+/CD24-细胞,并检测CD44的表达,以通过流式细胞术确定CD44的纯度。用MACS分离的癌症干细胞（CD44+/CD24-）比例的细胞计数分析结果>99%。我们发现,BCSCs具有形成肿瘤球的能力,并且使用高内涵系统免疫荧光技术发现CD44在肿瘤球中的表达显着增加。一小部分CD44+/CD24-细胞形成了肿瘤球。我们移植了从肿瘤球和非癌干细胞收集的200–300个癌症干细胞,并将它们注入受精后2 d的斑马鱼胚胎,以评估它们的增殖和迁移行为。在细胞移植后第6 d,观察到了来自2-dpf斑马鱼胚胎中乳腺球的MDA-MB-231-GFP细胞迁移至躯干。此外,与非CSC组相比,斑马鱼异种移植物中荧光颗粒的数量增加。然而,在细胞移植后的第3 d,用Di I标记并来源于肿瘤球的HCC1806细胞迁移到了2-dpf斑马鱼胚胎的躯干中。与非肿瘤干细胞相比,肿瘤干细胞在体内具有更高的致瘤性。为了探讨Gomisin M2是否能在体外抑制肿瘤球的形成,我们用Gomisin M2处理了MDA-MB-231 CSC和HCC1806 CSC群体48 h,并在没有Gomisin M2的情况下进行了另外两次肿瘤球培养。结果表明,Gomisin M2治疗后肿瘤球的大小和数量显着减少。使用高内涵筛选观察到核浓缩,细胞通透性,线粒体膜电位和细胞色素c释放。根据总强度除以体积,定量结果表明,阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,细胞通透性和细胞色素c的荧光强度增加,而线粒体膜电位显着降低。阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,总核强度的蓝色荧光减弱。此外,Western blot结果表明在MDA-MB-231和HCC1806中,应用不同浓度的Gomisin M2作用48 h后,细胞色素c的表达显着增加。为了确定最有效的Gomisin M2化合物对癌细胞的细胞毒性是否是由凋亡引起的,我们使用IC50值小于60μmol/L的Gomisin M2化合物在MDA-MB-231和HCC1806细胞中进行了凋亡分析。我们通过流式细胞仪分析了Gomisin M2治疗的乳腺癌细胞的凋亡。细胞分别用20μM,40μM和60μM Gomisin M2处理48 h。结果表明,Gomisin M2以剂量依赖性方式显着增加了MDA-MB-231和HCC1806细胞系中凋亡细胞的数量。然后流式细胞术分析了MDA-MB-231和HCC1806细胞凋亡的百分比。此外,Gomisin M2以剂量依赖性方式诱导了两种细胞系中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达。为了研究Gomisin M2是否通过阻断DNA合成来诱导细胞增殖抑制,我们评估了Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806中DNA复制的影响。Brd U分析的结果表明Gomisin M2对细胞增殖和DNA合成具有抑制作用。为了进一步评估Gomisin M2在体内的抗乳腺癌肿瘤干细胞效果,使用了斑马鱼模型进行评估。从MDA-MB-231-GFP和HCC1806（用Di I标记）富含的肿瘤干细胞重悬于PBS中将200-300个干细胞显微注射到2-dpf斑马鱼胚胎中。然后,斑马鱼胚胎用10μM Gomisin M2处理。植入后0 h,24 h和48 h通过荧光显微镜捕获荧光密度。结果表明,Gomisin M2处理显着降低了富含CSC的MDA-MB-231或HCC1806细胞的生长和增殖。定量结果表明,与对照组相比,Gomisin M2组在48 h内荧光强度逐渐降低。另外,与DMSO组相比,在48 h内没有增殖的胚的百分比显着增加。为了研究Gomisin M2对乳腺肿瘤干细胞的作用所涉及的机制,我们通过蛋白质印迹分析评估了涉及肿瘤进展的关键信号转导通路的参与。许多研究表明,Wnt/β-catenin通路在调节干细胞自我更新中起关键作用。我们的结果清楚地表明,在MDA-MB-231和HCC1806细胞中,Gomisin M2以剂量和时间依赖性方式显着下调Cyclin D1,β-catenin或p-GSK3β,并上调p-β-catenin或GSK3-β。综上所述,Gomisin M2是源自白钻的天然化合物,已被证明具有抗癌活性。这项研究表明Gomisin M2在体外和体内均能抑制乳腺癌干细胞,这为Gomisin M2或白钻提取物对乳腺癌化学预防的未来临床评估提供了强有力的依据。乳腺癌是由少数乳腺癌干细胞引发并维持的。当前可用的化学疗法和放射疗法不能抑制癌症干细胞群体。乳球形成试验表明,Gomisin M2在体外能抑制乳腺癌干细胞。斑马鱼异种移植模型显示Gomisin M2在体内消除了乳腺癌干细胞。此外,我们的结果表明,通过Gomisin M2对Wnt/β-catenin信号通路的下调是其功效的可能机制之一。这些数据表明Gomisin M2可能在乳腺癌治疗中具有潜能。