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目的通过建立小胶质细胞（BV2）外泌体与PQ处理MN9D细胞的PD模型之间的有效孵育模型,以探索炎性外泌体对MN9D细胞以及MN9D细胞构建的PD体外模型退行性改变的作用,并期望揭示功能性miRNA在小胶质细胞—外泌体—多巴胺能神经元细胞之间的分子传递及生物调控机制,为小胶质细胞分泌的外泌体作用于病理性神经元的机制研究提供重要依据。方法1.通过梯度离心结合过滤的方法提取BV2细胞上清液中的外泌体,电镜观察其形态;Western Blot检测外泌体的标志蛋白CD63和TSG101;纳米流式仪检测外泌体的浓度及粒径;2.纳米流式仪检测40μM PQ处理后BV2细胞释放的外泌体的粒子浓度;Western Blot检测40μM PQ处理BV2细胞后Rab27a蛋白表达水平及其外泌体的标志蛋白CD63表达水平（n=3）;3.通过PKH26荧光染料标记BV2细胞外泌体,将其与MN9D共培养6 h、12 h、24 h后激光扫描共聚焦显微镜观察外泌体与MN9D细胞的作用方式;观察100μM PQ处理MN9D细胞24 h后对BV2细胞外泌体的摄取情况（n=3）;4.BV2细胞外泌体与MN9D细胞有效作用模型（EXO-PD模型）:40μM PQ处理BV2细胞后提取上清液中的外泌体,将其与MN9D细胞预处理12 h后再PQ处理24 h,对MN9D细胞进行后续表型试验;5.不同剂量PQ处理MN9D细胞24 h,通过Parkin/PINK1蛋白表达检验体外PD模型的构建效果;6.EXO-PD模型中PD相关表型的变化。CCK8方法检测EXO-PD模型的增殖活性（n=6）;Western Blot检测EXO-PD模型PD相关蛋白（Parkin、PINK1、TH）、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl2、caspase 3、caspase 9）的表达情况（n=3）;免疫荧光法检测EXO-PD模型中增殖相关基因ki67及α-突触核蛋白在胞内的表达情况（n=3）;流式细胞术检测EXO-PD模型的凋亡水平（n=3）。7.高通量测序筛选PQ处理BV2细胞后其外泌体中的差异miRNAs,利用miRanda软件分析差异表达的miRNAs的靶基因,对筛选靶基因采用GO分析和pathway分析;qRT-PCR验证PQ处理BV2细胞胞内及其释放的外泌体中差异miRNAs的表达情况;qRT-PCR检测不同浓度外泌体处理MN9D细胞后差异miRNAs的表达情况;8.利用qRT-PCR检测EXO-PD模型中差异miRNAs的表达情况;通过小干扰RNA功能性抑制BV2细胞miR-92a-3p后提取上清液中的外泌体,qRT-PCR检测差异miRNAs的表达情况;通过小干扰RNA功能性抑制BV2细胞、MN9D细胞miR-92a-3p、miR-24-3p,Western Blot检测预测的靶基因的蛋白表达情况。结果1.电镜下观察到提取的外泌体样本具有双层膜的茶托样特异性结构,纳米流式仪显示颗粒粒径范围在50-150 nm之间,Western Blot检测外泌体的标志蛋白CD63、TSG101,未检测到阴性蛋白Calnexin,符合外泌体提取样本标准。2.纳米流式法检测到百草枯处理小胶质细胞上清液中提取的颗粒浓度增加,CD63蛋白的表达量显著增高。PQ处理BV2引起囊泡运输调节蛋白Rab27a蛋白表达下降。3.激光扫描共聚焦显微镜3D层扫证明MN9D细胞通过内化的方式摄取BV2外泌体,并且摄取数量随着孵育时间的增加而增加,在12 h左右摄取数量达到峰值;PQ处理MN9D细胞后其内化BV2细胞外泌体的含量显著下降。4.不同剂量PQ处理MN9D细胞24 h可引起Parkin、PINK1蛋白表达显著下降;BV2细胞的外泌体提高正常状态下MN9D细胞的增殖活性,同样的外泌体抑制PQ处理的MN9D细胞的增殖活性;5.BV2细胞外泌体引起正常状态MN9D细胞Parkin、PINK1、TH、p-TH（Ser40）蛋白表达升高,而PQ处理的MN9D细胞摄入外泌体后,Parkin、PINK1、TH、p-TH（Ser40）蛋白则低表达;PQ处理提高MN9D细胞α-突触核蛋白的表达水平,α-突触核蛋白在胞内明显聚集,而PQ-MN9D细胞摄取BV2细胞外泌体后,进一步上调了其α-突触核蛋白的表达;Ctrl-EXO降低正常状态的MN9D细胞α-突触核蛋白表达水平;6.MN9D细胞摄入BV2细胞的外泌体后,Bax、cleave-caspase 3、cleave-caspase 9蛋白表达升高、Bcl2蛋白表达下降;pro-caspase 3、pro-caspase 9在该培养同剪接后蛋白趋势相同。BV2细胞的外泌体与PQ-MN9D细胞孵育,引起MN9D细胞Bax、cleave-caspase 3、cleave-caspase 9蛋白表达下降;Bcl2表达上升。7.PQ处理引起BV2细胞外泌体中miRNAs表达谱改变,筛选出差异表达的miRNAs共227条,且发现PQ处理引起BV2细胞外泌体中总miRNAs的相对表达量整体显著高于对照组;8.PQ处理BV2细胞引起其胞内miR-92a-3p表达水平下降,miR-24-3p显著上升,而在其外泌体中miR-92a-3p和miR-24-3p的表达水平升高;1×105/partical数量外泌体处理时可显著提高MN9D细胞miR-92a-3p的表达量,而同更高数量的外泌体孵育时MN9D细胞miR-92a-3p升高不显著;MN9D细胞miR-24-3p的表达水平不发生显著改变;9.Ctrl-EXO引起正常状态的MN9D细胞中miR-92a-3p略微升高、miR-24-3p的表达量不变,而外泌体却引起PQ损害状态下的MN9D细胞miR-92a-3p、miR-24-3p表达水平显著下降;功能性抑制BV2、MN9D细胞miR-92a-3p、miR-24-3p表达后,Rap1b、PTCK1、Per2蛋白表达升高;10.Rap1b蛋白在PQ处理的MN9D细胞中表达明显下降,而敲低miR-92a-3p则缓解了PQ下降Rap1b的作用。结论1、百草枯处理促进小胶质细胞增加外泌体的释放量,抑制多巴胺能神经元细胞摄取来自小胶质细胞的外泌体。2、小胶质细胞外泌体改变多巴胺能神经元细胞增殖活性、PD相关蛋白表达水平及凋亡水平,在正常生理状态下表现出延缓退行性改变的作用,而在PQ诱导的PD损害模型则发挥了加剧退行性改变的作用。3、生理与病理状态MN9D细胞接收到小胶质细胞外泌体后miR-92a-3p、miR-24-3p表达变化不同,说明受体细胞状态也改变了基因传递现象。4、miR-92a-3p通过抑制靶基因per2、Rap1b蛋白表达从而参与PQ诱导的神经退行性损害作用。