【摘 要】
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甘草是我国常用的最大宗药材之一,素有“国老”、“十方九草”之美誉。《中华人民共和国药典》规定甘草酸是评价甘草质量的指标性成分之一。本课题组前期对光果甘草进行了转录组分析,发现:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS）基因和阿魏酸 5-羟化酶（Ferulate 5-hydroxylase,F5H）基因是影响甘草酸生物
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甘草是我国常用的最大宗药材之一,素有“国老”、“十方九草”之美誉。《中华人民共和国药典》规定甘草酸是评价甘草质量的指标性成分之一。本课题组前期对光果甘草进行了转录组分析,发现:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS）基因和阿魏酸 5-羟化酶（Ferulate 5-hydroxylase,F5H）基因是影响甘草酸生物合成的关键差异基因,其表达量与甘草酸含量呈负相关。本论文在前期转录组分析的基础上,从光果甘草cDNA文库中克隆得到DXS和F5H基因cDNA序列;使用基因融合法分别构建过表达DXS、F5H基因植物双元表达载体;使用在线工具分别设计两基因的sgRNA序列,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;使用电击转化法构建携带以上质粒的ATCC15834发根农杆菌工程菌;使用发根农杆菌工程菌侵染甘草无菌苗获得过表达和沉默DXS、F5H基因的甘草毛状根体系;使用UPLC法测定毛状根中的甘草酸的含量;分析DXS和F5H基因影响甘草酸生物合成的分子机制。本论文取得如下结果:（1）光果甘草DXS和F5H基因cDNA序列调取:从光果甘草cDNA文库中克隆得到DXS和F5H基因cDNA序列,于DH5α大肠杆菌中保存,并将序列信息上传GenBank数据库（Accession Number:DXS:MN158121;F5H:MK882511）。（2）植物双元表达载体构建:以pCAMBIA1305.1 质粒为载体,以Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ为插入位点,使用基因融合法构建过表达DXS、F5H基因的植物双元表达载体,于大肠杆菌TOP 10细胞中保存。（3）基因编辑载体构建:使用在线工具Benchling分别设计DXS和F5H基因的sgRNA序列,以携带CRISPR/Cas9蛋白的pHSE401质粒为载体,以BsaⅠ为酶切位点,构建基因编辑载体,于大肠杆菌TOP 10细胞中保存。（4）过表达DXS、F5H基因甘草毛状根系构建:使用电击转化法将过表达DXS、F5H基因的植物双元表达载体转化进入ATCC15834发根农杆菌感受态细胞并进行PCR验证和测序验证;使用验证成功的重组发根农杆菌工程菌侵染甘草无菌苗,获得甘草毛状根组织,使用PCR法及测序法鉴定筛选过表达DXS、F5H基因甘草毛状根系。（5）DXS、F5H基因沉默甘草毛状根系构建:使用电击转化法将CRISPR/Cas9基因编辑载体转化进入ATCC15834发根农杆菌感受态细胞并进行PCR验证和测序验证;使用验证成功的重组发根农杆菌工程菌侵染甘草无菌苗,获得甘草毛状根组织,使用克隆测序法鉴定成功编辑的甘草毛状根体系。（6）甘草毛状根体系中甘草酸含量测定分析:使用UPLC法检测野生型（1个样品）、阴性对照组（2个样品）、基因过表达组（17个样品）及基因沉默组（7个样品）共27份甘草毛状根样品中甘草酸的含量。统计学分析显示DXS、F5H基因沉默甘草毛状根体系中甘草酸含量显著高于野生型和阴性对照组甘草毛状根;而DXS、F5H基因过表达甘草毛状根体系中甘草酸含量则显著低于野生型和阴性对照组甘草毛状根。（7）DXS、F5H基因对甘草酸生物合成的调控:本论文通过逆向遗传学策略,从基因过表达和基因沉默两个方面证实了DXS和F5H基因的功能,其表达水平与甘草酸含量呈负相关,在甘草酸生物合成过程中起负调控作用,此结论与前期转录组测序结果相符。
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