多肽和核酸适体是两类重要的人工合成的分子受体,可以与离子、有机小分子、多肽、蛋白质等靶标进行高亲和力、特异性结合。与传统天然分子受体如抗体和酶相比,多肽和核酸适体具有超越传统天然分子受体的很多优点,如分子量小、合成简单、易于修饰、稳定性好、靶分子范围广等。正是由于上述独特的优势,多肽和核酸适体被认为有望取代或弥补传统天然分子受体不足而成为新一代分子识别元件,为高灵敏、高特异性生物传感技术的发展提供了新型有效的研究工具。近年来,多肽和核酸适体作为理想的分子受体已经被成功应用于构建生物传感器,且发展十分迅速,并在疾病诊断与治疗、食品检测、药毒物检测、环境监测等方面显示出巨大的应用前景。尽管如此,但是基于多肽和核酸适体的生物传感器研究尚不成熟,仍存在面临着一些挑战性问题,如灵敏度相对较低、检测范围窄、抗干扰能力低、分析通量低等。围绕上述挑战性问题,本论文以功能多肽和核酸适体作为分子识别元件,结合纳米技术和核酸等温信号放大技术的优势,发展了一系列简单、快速、灵敏度高、特异性好的生物传感新方法,并将其应用于复杂样品中有机小分子和蛋白质的测定,具体研究内容包括以下四个方面:1.以核酸适体为分子受体、癌胚抗原(CEA)为荧光偏振增敏剂以及聚合酶和限制性核酸内切酶为生物催化剂,我们构建了一种集成靶标识别、蛋白质增敏信号、等温指数扩增反应的新型多功能蛋白质-核酸适体复合纳米分子机器用于超灵敏荧光偏振检测有机小分子。在该体系中,增敏剂CEA与发夹式核酸适体探针中的CEA适体序列结合形成靶标识别探针,荧光标记的引物作为信号探针。在没有目标物存在时,CEA功能化的发夹式核酸适体探针不能与荧光标记的引物杂交,进而不能引发等温指数扩增反应,此时由于荧光标记引物的分子量较小,体系的荧光偏振值很小。当向该体系引入目标物时,目标物与CEA功能化的发夹式核酸适体探针中的适体识别序列结合并打开发夹结构。打开的发夹式探针能与荧光标记的引物杂交。在聚合酶和单体的作用下,发生聚合反应,使目标物释放出来,并生成CEA功能化的双链DNA使荧光偏振值增大。而释放出来的目标物又能与另一 CEA功能化的发夹式核酸适体探针结合,引发新一轮聚合反应,形成目标物循环,并生成许多CEA功能化的双链DNA,使体系的荧光偏振值进一步增大。生物的CEA功能化双链DNA被Nb.BbvCI选择性切割,然后顺序引发切割-聚合-释放循环反应,使DNA引发链不断的生成和循环,最后生成大量荧光标记的CEA功能化DNA,从而实现荧光偏振信号放大。以黄曲霉素B1为模型分析物对其在荧光偏振适体传感分析的可行性进行了验证,可实现黄曲霉素B1的超灵敏检测,检测限达到了 0.24 pmol/L。通过改变靶标的核酸适体序列,所构建的纳米分子机器也可用于可卡因的超灵敏检测,检测限为18 pmol/L,这说明我们所构建的纳米分子机器在生物传感分析方面具有一定的通用性。2.利用核酸适体结构转换引发二次方循环放大的原理,结合氧化石墨烯(GO)的高效荧光淬灭性质,我们发展了一种简单、快速、超灵敏的荧光适体传感新方法用于CEA检测。在该传感器体系中,多功能发夹核酸适体探针的5’端含有部分单链且标记荧光染料,3’端在茎部分存在一个错配碱基。在没有目标物存在时,发夹核酸适体探针能稳定存在,不会引发基于聚合酶和核酸外切酶T7的二次方循环信号放大反应,此时发夹核酸适体探针被吸附在GO表面,荧光染料的荧光被淬灭。当CEA存在时,发夹核酸适体探针与CEA结合并发生构象变化重新杂交形成了 3’端为平端的发夹结构。在聚合酶的作用下,新形成的DNA发夹结构能引发聚合反应,生成5’端为平端的长链发夹结构,同时CEA被置换下来。释放出来的CEA又可与另一发夹核酸适体探针结合,引发新一轮聚合反应,形成目标物CEA循环放大,并生成许多5’端为平端的发夹DNA。这些5’端为平端的发夹DNA能够被核酸外切酶T7切割,并释放出单碱基标记的荧光染料,同时生成单链DNA。生成的单链DNA也与发夹核酸适体探针杂交形成5’端为平端的双链DNA。该5’端为平端的双链DNA又能被核酸外切酶T7切割,重新释放出单链DNA而引发新一轮切割反应,形成DNA循环放大。最后,大量荧光标记的发夹核酸适体探针被切割,释放出大量的单碱基标记荧光染料。单碱基标记荧光染料不能有效吸附在GO表面,此时体系的荧光显著增强。该方法只需单一核酸探针即可实现二次方循环放大,具有很高的灵敏度,对CEA的检测限达到28 fg/mL。此外,该方法还表现出了良好的特异性,并成功用于人血清中CEA含量的测定,其结果与传统酶联免疫分析法的测定结果一致。3.利用核酸适体结构转换引发等温指数扩增反应和脱氧核酶信号放大的原理,我们建立了一种超灵敏荧光适体传感新方法用于蛋白质检测。该传感体系包括三种核酸探针:发夹式DNA识别探针、引物和脱氧核酶的分子信标底物。只有在目标蛋白存在时,识别探针中的适体序列与目标蛋白结合并打开其的发夹结构,进而与引物杂交,并在聚合酶的作用下引发聚合反应,生成具有两个限制性内切酶Nb.BbvCI切割位点的双链DNA。同时,目标蛋白被置换下来。释放出的目标蛋白又可与另一识别探针结合,引发新一轮聚合反应,形成目标蛋白循环放大,并生成许多双链DNA。生产的双链DNA能够被Nb.BbvCI选择性切割并生成两个新的聚合位点,引发新的聚合反应,生成新的具有两个Nb.BbvCI切割位点的双链DNA,同时置换出被切割的引发DNA链和脱氧核酶序列。而生成的新双链DNA又可引发新一轮切割反应,从而形成聚合-切割-置换循环反应,产生许多引发DNA链和脱氧核酶序列。这些引发DNA链也能与识别探针杂交并引发聚合反应,形成DNA循环放大,同时生成许多具有两个Nb.BbvCI切割位点的双链DNA,进而促发聚合-切割-置换循环反应,形成指数扩增。指数扩增反应后,该体系生成了大量的脱氧核酶序列。这些脱氧核酶序列能与其分子信标底物杂交并催化循环切割底物,使分子信标中的荧光基团与猝灭基团分离,导致体系的荧光信号增强,从而实现信号放大检测目标蛋白。以CEA为模型蛋白对该传感方法进行了验证,结果表明该方法具有很高的灵敏度和很宽的线性范围。CEA的检测范围为10 fg/mL-10 ng/mL,检测限达到了 5.2 fg/mL。此外,该方法可以用于复杂生物样品分析。4.基于蛋白激酶磷酸化反应的特异性和GO的荧光淬灭特性,我们构建了一种高灵敏荧光生物传感器用于多种蛋白激酶活性的同时检测及其抑制剂筛选。首先将链霉亲和素修饰在GO表面,在没有蛋白激酶存在时,不同荧光染料标记的不同多肽底物均不能组装在GO表面,此时体系具有很强的背景荧光信号。当目标蛋白激酶存在时,蛋白激酶分别催化相应的多肽底物使其磷酸化,将生物素化三磷酸腺苷中的生物素-磷酸基团转移至多肽上,生成生物素化多肽。生物素化多肽产物可通过生物素与链霉亲和素之间的强亲和作用组装在GO表面,此时荧光染料靠近GO,染料的荧光被淬灭,从而实现多种蛋白激酶活性的同时检测。以蛋白激酶PKA、Abl和Src为模型分析物对该传感方法进行了验证,结果表明该方法具有较高的灵敏度,PKA、Abl和Src的检测限分别为0.005 U/mL、0.02 U/mL和0.05 U/mL。该方法还具有很高的选择性,成功应用于复杂生物样品——癌细胞裂解液中蛋白激酶活性的测定。此外,根据抑制剂能够抑制蛋白激酶磷酸化反应,从而削弱底物多肽与GO的相互作用,导致染料的荧光不能被有效淬灭,该传感方法还可以用于蛋白激酶抑制剂筛选。