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【研究背景及目的】胰腺癌(Pancreatic Cancer,PCa),是恶性程度最高的肿瘤之一,近年来发病率和死亡率逐渐升高。目前,手术切除是治疗该病的最佳途径。由于起病隐匿,进展快,易转移,多数患者确诊时已错失了手术良机。此外,胰腺癌分化程度低,对放、化疗的敏感性差。胰腺癌患者5年生存率约为4%,预后极差。胰腺癌的高度恶性、高病死率、治疗效果差,使其成为世界难题,引起人们的广泛关注。因此,探寻胰腺癌的特异性诊断方法和新的治疗靶点是目前迫切需要解决的问题。二甲双胍是临床上治疗2型糖尿病的常用药物之一。除了抑制肝脏葡萄糖输出、促进外周组织对葡萄糖的利用之外,二甲双胍还能改善胰岛素抵抗,降低甘油三酯和胆固醇水平,改善肥胖状态。近年来,多项临床研究表明,与服用其他降糖药物和注射胰岛素的2型糖尿患者相比,长期服用二甲双胍的患者发生胰腺癌的风险明显降低。体外实验也纷纷证实,二甲双胍可显著抑制Aspc-1,Panc-1,Sw1990等多种胰腺癌细胞株的恶性生物学行为,大剂量甚至有杀灭作用。有学者认为二甲双胍抑制胰腺癌生长的一部分原因是其降低了循环胰岛素水平,阻碍了胰岛素/胰岛素样生长因子-1(inslin-like growth factor-1,IGF-1)轴的促肿瘤作用。近来一些研究表明,二甲双胍诱导腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化,继而抑制或激活一些促癌或抑癌基因而发挥作用。目前,二甲双胍抑制胰腺癌发生发展的潜在机理尚未完全阐明,仍需我们进一步深入研究。本研究用二甲双胍处理胰腺癌细胞后,采用多种细胞和分子生物学方法验证二甲双胍对胰腺癌细胞增殖能力、细胞周期、凋亡水平以及迁移和侵袭能力的影响。然后利用基因芯片技术筛选与二甲双胍抑制胰腺癌作用相关的基因,分析其可能涉及的信号通路,并进一步探究二甲双胍对上述通路的调节作用。根据我们前期的工作基础,免疫组化检测发现Hippo通路核心蛋白MST1在胰腺癌和癌旁均为阴性;YAP在胰腺癌组织表达呈强阳性,而在癌旁组织中表达呈弱阳性,表明Hippo通路YAP活化参与胰腺癌的发生(此为同课题组高军教授的实验成果)。Hippo信号通路是一条抑制细胞生长的通路,主要介导细胞间的接触抑制,对维持器官大小及细胞增殖和凋亡的平衡都发挥关键的调节作用。我们以此推测,二甲双胍抑制胰腺癌的作用可能与Hippo通路相关。为了证实上述推测,我们重点关注Hippo信号通路因子在基因芯片上的表达情况,并初步探索二甲双胍抑癌效应与Hippo信号通路的关系。【实验方法】1.体外培养人胰腺癌细胞株PANC-1,用5,10,15,20,40mmol/L的二甲双胍分别处理细胞24h,48h,60h,72h,同时以不加药物处理的细胞作为对照组。采用CCK-8法检测二甲双胍对细胞增殖力的影响。并根据细胞抑制率获取半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)进行以下实验研究。2.用IC50浓度的二甲双胍处理PANC-1细胞48h,同时设对照组(不加二甲双胍处理),用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。3.实验分组及药物处理同上,采用划痕愈合实验检测PANC-1细胞迁移能力的变化。4.Transwell小室侵袭实验检测PANC-1细胞的体外侵袭能力。5.利用基因芯片技术筛选出与二甲双胍抑制胰腺癌作用相关的基因,并分析其可能涉及的信号通路。6.分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测二甲双胍对上述信号通路的影响。【实验结果】1.二甲双胍能显著抑制PANC-1细胞的增殖能力,并呈剂量依赖性。二甲双胍抑制PANC-1细胞增殖的IC50值约为20mmol/L,故选取20mmol/L二甲双胍处理细胞48h进行后续实验。2.PANC-1细胞经20mmol/L二甲双胍处理48h后,细胞周期阻滞在G0/G1期,S期缩短,且细胞发生显著凋亡。3.划痕愈合实验结果发现,对照组细胞在划痕处愈合较快,48h后划痕基本完全愈合,而处理组细胞划痕愈合较慢,表明二甲双胍能抑制PANC-1细胞的迁移能力。4.Transwell小室侵袭实验显示,对照组的穿膜细胞数明显多于二甲双胍处理组,这表明二甲双胍可显著抑制PANC-1细胞的体外侵袭能力。5.基因芯片结果示:处理组与对照组相比,Hippo信号通路因子YAP1、MST1、TEAD3表达差异显著。6.二甲双胍处理后,PANC-1细胞中Hippo信号通路因子MST1、LATS1、YAP1m RNA的相对表达量均升高;MST1、LATS1及磷酸化YAP1的蛋白表达水平均显著高于对照组,而YAP1总体表达水平无明显差异。【实验结论】二甲双胍可显著抑制胰腺癌细胞PANC-1的增殖、迁移及侵袭能力,并影响其细胞周期,促进凋亡。二甲双胍对PANC-1细胞的生长抑制作用主要通过抑制增殖、促进凋亡和阻滞细胞周期发挥。二甲双胍可以通过激活Hippo信号通路,使致癌因子YAP磷酸化失活,不能有效入核及启动其下游促癌靶基因表达,从而发挥肿瘤抑制作用。