耐药菌感染对畜牧业和公共卫生造成了巨大威胁。噬菌体能特异感染并裂解细菌,被认为是治疗耐细菌感染的理想候选方案。细菌的防御系统能抵御噬菌体的感染,而噬菌体也进化出能耐受细菌防御系统的反机制,于是关于它们防御机制与反机制的研究就成了开发噬菌体治疗的关键。本研究旨在以T4噬菌体作为模型,研究基因组DNA共价修饰在耐受细菌防御系统中所起到的作用,为噬菌体治疗提供理论指导。具体内容如下:1.T4噬菌体DNA共价修饰耐受不同类型CRISPR系统的研究CRISPR系统是依赖核酸酶活性的细菌防御系统,现已发现6种类型（I-VI）,其中I,II和V型主要靶向DNA。实验室前期研究表明,野生型T4噬菌体（WT T4）能通过基因组的胞嘧啶羟甲基化糖基化共价修饰（ghm C）耐受I型和II型CRISPR系统。为探究WT T4基因组ghm C是否也能耐受V型CRISPR系统,构建了多个靶向T4基因组的V型CRISPR系统质粒载体,转化至大肠杆菌B834,分别用WT T4和胞嘧啶修饰缺陷型T4噬菌体（T4（C））感染。结果显示,WT T4产生的噬斑数明显多于T4（C）,表明ghm C修饰可以耐受V型CRISPR系统。为进一步探究ghm C修饰对不同类型CRISPR系统耐受程度,构建靶向或裂解WT T4相同区域的有II型和V型CRISPR系统,转化至大肠杆菌,用WT T4分别感染。结果显示,含有II型CRISPR系统的大肠杆菌培养皿表面形成的噬斑数更多,表明ghm C修饰对II型CRISPR系统耐受程度更高,而造成这种现象的原因可能是V型CRISPR的Cas蛋白拥有更加开放的结构。研究表明,CRISPR系统的特异性间隔序列（Spacer）的数量与CRISPR系统抵御噬菌体感染的能力呈正相关。为探究多种靶向不同位点的CRISPR复合物是否能更有效地抵御噬菌体的感染,分别构建相应靶向WT T4的单个位点和两个不同位点的V型CRISPR系统质粒,转化至大肠杆菌,用WT T4分别感染。结果显示,含有靶向两个不同位点的CRISPR系统的大肠杆菌培养皿表面形成的噬菌斑更少,表明多种靶向不同位点的CRISPR复合物是能更有效地抵御噬菌体的感染。前面的结果表明,ghm C修饰能耐受V型CRISPR系统。为此,本研究进一步探究了在V型CRISPR系统的压力下,WT T4的子代噬菌体中对应的原间隔序列（Protospacer）或原间隔序列临近基序（PAM）是否会发生变化。本研究将WT T4在相同的V型CRISPR系统的压力下传代培养,并挑取各代的噬菌体斑块进行PCR扩增并测序。结果显示,在持续的V型CRISPR系统的压力下,Protospacer或PAM存在突变的子代噬菌体的比例会持续增高,表明CRISPR系统是一把双刃剑,它在抵御噬菌体感染的同时,也在驱动噬菌体的快速进化。2.T4噬菌体DNA共价修饰耐受细菌的Thoeris系统研究细菌Thoeris防御系统由Ths B与Ths A蛋白组成,其中Ths B含有TIR结构域,该结构域广泛存在于动植物病原体相关分子模式受体中,在动植物识别和应答病原体过程中起关键作用。研究表明蜡样芽孢杆菌Thoeris系统的Ths B蛋白能识别噬菌体感染,并能激活下游Ths A蛋白的抗病毒活性,但Ths B识别噬菌体的机制未知。本研究分别用WT T4和T4（C）感染E.coli Nissle 1917时,发现只有WT T4能完成复制周期,产生子代病毒,表明该菌株能够区分两种T4噬菌体的基因组。对其基因组序列分析发现,Thoeris系统可能是主要原因。为了研究大肠杆菌Thoeris系统识别和防御T4噬菌体的机制,本研究克隆了Nissle 1917的Thoeris系统,该系统包含tcp C,RS11255和RS11260蛋白,其中tcp C和RS11255都含有TIR结构域,类似芽孢杆菌Thoeris系统的Ths B。分别利用大肠杆菌B834和DH10B,进一步证实了只有WT T4能在含有Thoeris系统的菌株中形成噬菌斑,表明Thoeris系统能抵御T4（C）,但不能抵御WT T4感染。对Thoeris系统进行功能域分析,未发现核酸酶结构域,表明该系统不是通过切割噬菌体DNA区分WT T4和T4（C）基因组,提示T4噬菌体可能通过ghm C修饰逃逸Thoeris系统的识别。为了探究大肠杆菌Thoeris系统的防御机制,分别构建了缺失tcp C,RS11255和RS11260基因的Thoeris系统,分别转化至大肠杆菌DH10B,并用T4（C）感染,通过噬菌斑实验分析了上述Thoeris系统对T4（C）的防御能力。结果显示,缺失tcp C基因没有影响Thoeris系统的防御能力,缺失RS11255和RS11260基因的Thoeris系统丧失了抵御T4（C）的能力。为进一步探究基因组修饰对Thoeris系统的逃逸能力,通过CRISPR基因编辑技术分别构建了仅含有胞嘧啶α-糖基化修饰的T4（α-ghm C）噬菌体、仅含有胞嘧啶β-糖基化修饰的T4（β-ghm C）噬菌体、仅含有胞嘧啶羟甲基化修饰的T4（hm C）噬菌体。通过噬菌斑实验分析了Thoeris系统对不同修饰程度的T4噬菌体的防御效率,结果显示,T4（C）和T4（hm C）成斑效率显著低于T4（α-ghm C）和T4（β-ghm C）,表明糖基化修饰是T4逃逸Thoeris系统的关键,羟甲基化修饰的噬菌体DNA不能逃逸Thoeris系统。通过生物信息学分析发现RS11255蛋白TIR结构域和RS11260蛋白NAD分子结合域含有保守的酶催化中心,RS11260蛋白的氨基端含有跨膜区结构域。本研究发现突变RS11255或RS11260的保守催化位点,删除RS11260蛋白的跨膜区结构域后,Thoeris系统都会丧失抵御T4（C）感染的能力。这意味着,TIR结构域和NAD分子结合域都是Thoeris系统发挥抗病毒功能所必需的,且RS11260蛋白需要在细胞膜上才能发挥抗病毒功能。通过噬菌体裂解细菌曲线实验发现,大肠杆菌Thoeris系统是通过引发细菌流产感染的方式抵御T4（C）感染。这些结果提示Thoeris系统通过RS11255识别噬菌体感染,利用RS11260蛋白引发细菌流产感染发挥抗病毒功能。为了进一步探究RS11260的抗病毒活性是否需要RS11255蛋白的激活,本研究用阿拉伯糖诱导表达载体,分别构建了RS11260蛋白表达载体、RS11260和RS11255蛋白共表达载体,分别导入大肠杆菌DH10B。T4（C）和T4（hm C）感染实验显示,只有共表达RS11260和RS11255蛋白才能抑制T4（C）和T4（hm C）感染,提示RS11260蛋白的抗病毒活性需要RS11255蛋白的激活。为了探究RS11255蛋白如何激活RS11260蛋白的抗病毒活性,本研究通过色谱-质谱（LC-MS）技术,发现RS11255蛋白可能具有降解NAD分子为ADPR分子的能力,这表明ADPR分子可能是RS11260蛋白抗病毒活性的激活剂。以上结果提示,RS11255蛋白识别噬菌体DNA后,降解NAD分子为ADPR分子,产生的ADPR分子激活下游RS11260蛋白抗病毒活性,最终引发细菌流产感染。3.新型噬菌体基因编辑技术的开发鉴于V型CRISPR系统切割ghm C基因组的效率更高,本研究用该系统开发了新型高效的噬菌体基因组编辑技术。该系统含有表达V型CRISPR-Cas的质粒和用于同源重组的供体质粒,其中表达的CRISPR-Cas复合物负责切割噬菌体基因组,而供体质粒与断裂的噬菌体基因组DNA发生同源重组,从而将目标DNA重组到噬菌体基因组。为了评估该方法的编辑效率,本研究首先选择了片段长度为1~2kb的α-糖基化基因和β-糖基化基因,通过同源重组分别得到了T4（α-ghm C）,T4（β-ghm C）和T4（hm C）突变体,重组效率约10-3~10-4,且没有野生型T4噬菌体背景。为进一步评估编辑DNA长片段的能力,本研究尝试缺失了T4噬菌体39和56基因之间的~10.8kb片段,该区段编码非必需基因,缺失后不影响噬菌体的增殖。结果显示,利用该编辑系统可以高效的获得重组噬菌体,重组效率为10-3,同样也无野生型T4噬菌体背景。为了评估该技术编辑其他噬菌体的效率,本研究分别在T7基因组的4,5,9,和19基因上进行了定点突变,均能够有效地获得预期突变体,重组效率为10-3~10-5,并且产生很少的T7噬菌体背景。以上结果表明,基于V型CRISPR系统的噬菌体基因编辑技术是非常有效的基因编辑工具,能高效地对菌体基因组进行点突变和基因缺失。综上所述,本研究揭示了T4噬菌体通过DNA共价修饰耐受细菌CRISPR和Thoeris防御系统;细菌通过表达靶向不同位点的Cas复合物增强其切割共价修饰DNA的能力;基于V型CRISPR系统成功开发了新型噬菌体基因编辑技术。