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本课题首先研究了Sema4D在PDR患者及非PDR患者玻璃体内表达的差异,在此基础上以人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,hRPE)为研究对象,通过体外培养hRPE细胞,构建高糖诱导细胞模型,检测相关指标的表达。通过RNA干扰技术沉默Sema4D基因表达,验证其对高糖培养状态下hRPE细胞表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(Metalloprotinase-9,MMP-9)的影响,分析Sema4D和Plexin-B1在糖尿病视网膜病变过程中可能的作用及机制。 第一部分 糖尿病视网膜病变患者玻璃体中Seme4D、MMP-9和VEGF的表达及意义 目的:研究Sema4D、MMP-9和VEGF在PDR患者及非PDR患者玻璃体中的表达情况,探讨其在PDR发展过程中可能的作用。 方法:1.临床资料:增生性糖尿病视网膜病变的患者40例(40眼)设为实验组,其中20例患者(20眼)玻璃体切除术前接受抗VEGF药物玻璃体腔注射治疗,设为A组,其余20例患者(20眼)直接行玻切手术,设为B组,无糖尿病史的黄斑裂孔的患者20例(20眼)设为对照组。分别记录患者的年龄、性别等数据资料,所有患者行常规眼科检查,玻切手术中采集入组患者的玻璃体液标本。 2.使用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组患者的玻璃体中Sema4D、MMP-9以及VEGF的含量。 3.统计学分析,比较各组样本表达含量之间的差异。 结果:1.Sema4D(ng/ml)浓度在实验组A、实验组B及对照组的患者玻璃体中分别为(2.18±0.67)、(2.60±1.14)、(0.44±0.23),两实验组患者的玻璃体内Sema4D含量均明显高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。 2.MMP-9(ng/ml)浓度在实验组A、实验组B及对照组的患者玻璃体中分别为(3.55±1.71)、(2.97±1.64)、(0.70±0.29),两实验组患者的玻璃体内MMP-9含量均明显高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。 3.VEGF(pg/ml)浓度在实验组A、实验组B及对照组的患者玻璃体中分别为(237.36±91.20)、(920.12±166.51)、(144.26±45.59),实验组B的患者玻璃体内VEGF含量均明显高于实验组A和对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。 小结:1.Sema4D、MMP-9、VEGF在增殖性糖尿病视网膜病变患者的玻璃体内呈高表达状态。 2.抗VEGF药物可明显下调玻璃体腔内VEGF的表达,但对Sema4D的表达水平影响无统计学意义。 第二部分 高糖培养环境对人视网膜色素上皮细胞表达Sema4D/plexin-B1的影响及意义 目的:建立高糖培养环境的hRPE细胞模型,检测不同糖浓度及不同培养时间条件下,RPE细胞表达Sema4D、Plexin-B1、MMP-9和VEGF的变化。 方法:1.以人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19细胞株)作为研究对象,选取对数生长期细胞随机分为正常糖浓度组(对照组)及高糖浓度组(实验组)两组。 2.分别在5.56mmol/L葡萄糖(对照组)和25mmol/L葡萄糖(高糖组)的条件下培养12h、24h及48h后进行检测。 3.观察结果,以ELISA方法检测hRPE细胞培养液上清中Sema4D、VEGF及MMP-9的含量,免疫荧光化学染色法观察Sema4D、Plexin-B1、MMP-9、VEGF在hRPE细胞的表达定位及强度,Western blot法定量检测hRPE细胞内Sema4D、Plexin-B1、MMP-9和VEGF的蛋白表达量。 结果:1.Sema4D浓度(ng/ml)在12h、24h、48h的检测结果,对照组上清液中分别为(0.45±0.83)、(0.43±0.16)、(0.59±0.07),实验组中分别为(0.49±0.03)、(2.15±0.24)、(4.19±0.95),24h及48h两组结果之间差异有统计学意义(P<0.01)。 2.MMP-9浓度(ng/ml)在12h、24h、48h的检测结果,对照组上清液中分别为(0.28±0.04)、(0.35±0.08)、(0.31±0.05),实验组分别为(1.02±0.18)、(1.66±0.31)、(1.96±0.21)。三个时间节点条件下,两组之间差异均有显著统计学意义(P<0.01)。 3.VEGF浓度(pg/ml)在12h、24h、48h的检测结果,对照组上清液分别为(194.85±5.51)、(203.83±7.43)、(220.99±19.55),实验组分别为(651.78±149.57)、(1036.37±168.41)、(1071.40±117.04)。三个时间节点条件下,两组之间差异均有显著统计学意义(P<0.01)。 小结:1.在高糖培养液环境培养的hRPE细胞上清液内,Sema4D、MMP-9、VEGF呈高表达。 2.高糖环境可刺激hRPE细胞内Sema4D、Plexin-B1、MMP-9和VEGF蛋白表达量上调。 第三部分 siRNA沉默Sema4D对高糖培养视网膜色素上皮细胞的影响 目的:通过靶向沉默hRPE细胞的Sema4D基因表达,研究抑制Sema4D对高糖环境下hRPE细胞表达Plexin-B1、MMP-9、VEGF的影响。 方法:1.利用合成siRNA转染hRPE细胞,设置空白对照组和转染无意义siRNA片段的阴性对照组(NC组),荧光定量PCR检测Sema4D mRNA表达,验证转染效率,选择靶向沉默Sema4D效果最强的序列,建立转染成功的细胞模型。 2.将各组细胞分别在5.56mmol/L正常糖浓度(对照组)和25mmol/L高糖浓度(实验组)条件下,继续培养48h,分为6组:Control、Control+NC、Control+Sema4D siRNA、HG、HG+NC、HG+Sema4D siRNA。 3.以ELISA方法检测各组细胞培养液上清中VEGF及MMP-9的含量,免疫荧光化学染色法观察Plexin-B1、MMP-9、VEGF在hRPE细胞的表达定位及强度,Western blot法定量检测hRPE细胞内Plexin-B1、MMP-9、VEGF、p-p38和p-JNK的平均灰度值。 结果:1.Sema4D siRNA组的Sema4D mRNA表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组,差异被认为有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组之间差异则无统计学意义(P>0.05) 2.按照上述6组分组顺序,检测RPE细胞培养液上清中MMP-9浓度(ng/ml),分别为(0.33±0.12)、(0.28±0.06)、(0.36±0.20)、(2.01±0.30)、(1.89±0.26)、(1.12±0.33),HG+Sema4D siRNA组MMP-9的浓度明显低于对照组和转染NC组,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。 3.VEGF浓度(pg/ml)在6组中分别为(265.13±30.52)、(204.89±17.66)、(303.09±70.64)、(1132.31±125.97)、(989.47±165.54)、(920.56±105.68)。HG+Sema4D siRNA组VEGF的浓度较对照组和转染NC差异无统计学意义(P>0.05)。 小结:1.以Sema4D为靶基因,构建了siRNA转染沉默模型,成功抑制了Sema4D的表达。 2.敲低Sema4D可下调RPE细胞在高糖刺激下过表达的Plexin-B1、MMP-9。 3.敲低Sema4D对RPE细胞在高糖培养环境引起的VEGF过表达无明显影响。 4.Sema4D可以通过P38MAPK途径影响RPE细胞表达MMP-9。 结论:1.通过对PDR及非PDR患者玻璃体内Sema4D的检测,明确了Sema4D在PDR患者眼内的高表达,提示Sema4D可能在PDR患者的视网膜新生血管形成中发挥了一定作用。 2.以hRPE细胞为研究对象,建立高糖培养模型,验证了高糖环境能上调细胞内Sema4D、Plexin-B1、VEGF和MMP-9的表达强度。 3.在细胞水平通过siRNA干扰技术沉默Sema4D基因,能够影响P38MAPK信号通路,有效的下调Plexin-B1和MMP-9的表达,从而抑制新生血管的形成,干预Sema4D的表达可为研究和治疗糖尿病视网膜病变提供新的思路。