团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国主要的淡水养殖鱼类之一，具有重要的经济价值和科学研究意义。目前有关团头鲂的研究涉及基础生物学、遗传育种、营养与饲料、疾病与免疫、基因克隆与表达以及基因组学等多个方面，但对于团头鲂干细胞多能性相关因子的基础研究数据缺乏。作为具有代表性的干细胞因子，nanog和oct4已被证明在哺乳动物和部分硬骨鱼类早期胚胎发育阶段以及维持干细胞自我更新和分化方面起着举足轻重的作用，而鱼类nanog和oct4的结构、表达与功能同哺乳类相比有何特点尚不明确。本研究以团头鲂为实验对象，采用多种分子生物学和发育生物学实验技术，结合CRISPR/Cas9基因敲除等手段，初步阐明了团头鲂nanog(Mananog)和oct4(Maoct4)基因的结构特点、表达模式和部分生物学功能。研究结果表明Mananog和Maoct4均具有母源性表达的特征，其表达模式区别于哺乳动物Nanog和Oct4的表达模式;通过原核表达蛋白能够制备出兔抗团头鲂Nanog和Oct4特异性抗体;证明了Mananog和Maoct4可以跨物种作用于人肝癌细胞HepG2，提高其增殖能力、锚定依赖性生长能力和迁移能力;另外，本研究初步验证了Mananog可在一定程度上挽救斑马鱼因nanog缺失而造成的胚胎死亡和PGC异常迁移。主要研究结果如下:　　1)nanog基因:首先，在基因结构上，Mananog基因组DNA(genomic DNA，gDNA)全长3326bp，包括4个外显子和3个内含子;cDNA序列全长1556bp，包括编码序列(Coding sequence，CDS)1161bp，5非翻译区(Untranslated region，UTR)217bp和3UTR178bp;预计编码386个氨基酸残基的蛋白，预测蛋白分子量大小为42.46ku;包含一个保守的具有63个氨基酸残基的同源结构域，位于197-259处，其上有一保守的核定位模序YKQVKTWFQN;同时检测到Mananog可以产生2个转录异构体:Mananog848和Mananog683;氨基酸序列同源性分析结果显示团头鲂与其他鱼类的Nanog蛋白相似度在33％～80％之间，而与人和小鼠的蛋白相似度仅为16％和15％，但所有物种HD结构域相似度在49％～97％;系统进化树分析表明MaNanog与硬骨鱼类的Nanog处于同一分支，并与哺乳动物Nanog同源。其次，在表达模式上，本研究结果表明，Mananog主要在团头鲂胚胎发育的早期阶段表达，从1细胞期持续至原肠胚期末期，其中在囊胚期的表达量最高;整胚原位杂交结果进一步证明了Mananog在团头鲂胚胎的这些早期阶段表达，并且表达信号分布于整个卵裂球;在组织中，Mananog主要在成体性腺中表达，且在卵巢中的表达量高于精巢，另外在肝脏中也有一定表达;荧光原位杂交结果进一步表明MananogmRNA在卵巢中主要分布于卵原细胞、Ⅰ-Ⅱ期初级卵母细胞以及Ⅲ期初级卵母细胞的囊泡;在精巢中，精原细胞、精母细胞及精子细胞中均可检测到Mananog的表达;而在肝脏中，部分肝细胞内也检测到了荧光信号。此外，通过构建绿色荧光表达载体pEGFP-N1-Mananog并转染HepG2细胞，证明了MaNanog具有核定位的特性。再次，在抗体制备上，我们发现pET32a-Mananog原核表达载体在37℃以0.5mmol/L IPTG诱导4h可获得MaNanog重组蛋白的高效表达，制备的兔抗Nanog多克隆抗体能够有效识别原核表达MaNanog蛋白、团头鲂肝脏和精巢的内源MaNanog蛋白以及HepG2细胞中单独或融合表达的MaNanog蛋白。最后，在基因功能上，基因过表达结果显示外源因子Mananog等的转入能够引起HepG2细胞内干细胞相关转录因子NANOG、OCT4、KLF4和C-MYC表达量的显著变化;Mananog单独过表达或者与Maoct4或其它因子的共同过表达均能显著促进HepG2细胞增殖，增强其锚定依赖性生长能力以及迁移能力;在胚胎中，利用CRISPR/Cas9系统对斑马鱼nanog基因(Drnanog)的敲除实验发现，Drnanog的缺失可能会导致斑马鱼囊胚期的高死亡率与胚胎发育后期的高畸形率，其中畸形主要表现为尾部的弯曲，另外Drnanog基因的敲除还可能引起斑马鱼PGC迁移的紊乱;不过注入外源MananogmRNA可部分挽救斑马鱼因Drnanog缺失所导致的异常表型，而其异构体Mananog683则无法挽救。以上结果表明本研究获得的Mananog与哺乳动物和硬骨鱼类的Nanog基因同源，是与细胞多能性密切相关的主控因子，为后期进行团头鲂干细胞研究提供了重要的基础资料。　　2)oct4基因:首先，在基因结构方面，Maoct4gDNA全长5308bp，包括5个外显子和4个内含子;cDNA序列全长3397bp，包括CDS1419bp，5UTR373bp和3UTR1605bp;预计编码472个氨基酸残基的蛋白，预测蛋白分子量大小为51.92ku;含有特征性的POU结构域，由POUs特异结构域、POUHD同源结构域和二者之间的连接域组成，并且结构域中含有核定位序列RKRKR;同时本研究发现Maoct可以产生5个转录异构体:Maoct4-I1(834bp)、Maoct4-I2(726bp)、Maoct4-I3(435bp)、Maoct4-I4(387bp)和Maoct4-I5(366bp)。蛋白质序列比对结果表明MaOct4与其它硬骨鱼类Oct4蛋白的序列相似度较高，为47％-94％;而与四足类动物Oct4蛋白的序列相似度较低，为27％-33％;但POU结构域的序列相似度在57％-95％;系统进化树分析表明MaOct4与硬骨鱼类的Oct4处于同一分支，并与哺乳动物Oct4基因同源。其次，在表达模式方面，半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR结果显示，在胚胎中，Maoct4主要在胚胎发育的早期阶段表达，从1细胞期持续至神经胚期，且基因表达量随胚胎发育进程逐渐降低;整胚原位杂交实验结果进一步证明了Maoct在这些早期发育阶段表达，并且表达信号分布于整个卵裂球;在组织中，Maoct4主要在成体的性腺表达，且在卵巢中的表达量远高于精巢，在肝脏中也有一定的表达;荧光原位杂交实验结果表明Maoct的转录本在卵巢中主要分布于卵原细胞、Ⅰ-Ⅱ期初级卵母细胞以及Ⅲ期初级卵母细胞的囊泡;在精巢中，Maoct4主要分布于精原细胞和精母细胞，精子细胞中未检测到明显的Maoct4杂交信号;而在肝脏中，部分肝细胞内也检测到了荧光信号。另外，通过构建红色荧光蛋白表达载体pCMV-Maoct4-Red并转染HepG2细胞，证明MaOct4是核定位。再次，在抗体制备方面，构建的pET32a-Maoct4原核表达载体在37℃以0.5mmol/L IPTG诱导4h可获得Oct4重组蛋白的高效表达，制备的兔抗Oct4多克隆抗体能够有效识别纯化的MaOct4蛋白、原核表达的MaOct4蛋白、团头鲂胚胎中的内源MaOct4蛋白以及HepG2细胞中过表达的MaOct4∶DsRed融合蛋白。最后，在功能方面，Maoct4外源因子的转入亦能够引起HepG2细胞内干细胞相关转录因子NANOG、OCT4、KLF4和C-MYC表达量的显著改变，促进HepG2细胞增殖能力、锚定依赖性生长能力以及迁移能力的增强。总之，本研究获得的Maoct与硬骨鳖类和哺乳动物的Oct4基因同源，在胚胎早期发育及干细胞相关进程中发挥重要作用，更多研究有待进一步开展。　　综上所述，在团头鲂中克隆得到了两个重要的干细胞相关因子nanog和oct4，证明了它们是母源性基因，在胚胎发育的早期阶段和性腺的生殖细胞中表达，可能参与胚胎早期阶段发育以及生殖细胞的形成;同时制备了相应抗体，获得了稳定转染Mananog和Maoct的HepG2细胞系，并初步验证了两基因的部分功能，为将来深入研究鱼类干细胞奠定了基础。