传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因真核表达质粒的构建、表达及其DNA疫苗对鸡体的免疫保护

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sjmaomaoqiu
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自七十年代末国内首次分离传染性法氏囊病毒(IBDV)以来,国内学者在IBDV病毒形态结构和免疫学特性等方面作了大量研究。本室从90年代初也已开展分子生物学研究,1993年陈士友博士在国内首次构建成功IBDV cDNA文库,1997年姜平博士首次用Goldkey软件设计IBDV PCR引物,建立了RT-PCR法,获得了野毒株IBDV病毒主要结构蛋白VP2、VP3蛋白基因,并分别于原核表达载体中表达,研究其作为基因工程苗的可行性,为基因疫苗研究奠定了基础。1999年候继波博士构建了传染性法氏囊病毒A片段的cDNA文库并进行了全序列测定。 本研究在此基础上,从采自发病鸡场的法氏囊组织分离病毒,并进行琼脂扩散试验和鸡体回归试验,所得的病毒定名为IBDV 99J1株。首先参照标准株Cu-1序列,用Goldkey软件设计两对IBDV PCR引物,并在引物两个设计了酶切位点,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增并克隆了IBDV99J1的VP2基因,为进一步构建真核表达载体奠定了基础。将IBDV VP2插入真核表达质粒pcDNA3.1(-)及pCl中,置于CMV启动子的调控之下,构建成DNA疫苗表达质粒VP2pcDNA、VP2pCl,分别转染COS-7细胞,转染24小时后每12小时取细胞裂解液报道基因检测,并进行间接免疫荧光试验和Dot-ELISA检测,筛选出阳性表达的质粒。 用IBDV VP2重组质粒DNA及用含CpG、作为免疫增效剂的核酸分点肌肉注射14日龄非免疫鸡,21日龄再免一次,二次免疫后14天和21天测定血清ELISA抗体效价。并于免疫后21天用IBDV 99J1株攻毒,结果显示:1 VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组;2 VP2弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组,且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高;3 VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及VP2弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率;4重组质粒免疫及相关免疫组ELISA抗体持续产生。 尽管还不能与常规疫苗一样有效,但是该试验结果鼓励我们进一步向DNA疫苗努力。尤其是这种DNA疫苗没有散毒的危险。
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