【摘 要】
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该课题的主要技术路线是在验证了该实验室克隆的蚓激酶cDNA所表达的目的蛋白具有溶血栓作用以及山羊酪蛋白的调控序列(BCP)可以指导外源基因在乳腺中表达后,将BCP调控下的蚓
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该课题的主要技术路线是在验证了该实验室克隆的蚓激酶cDNA所表达的目的蛋白具有溶血栓作用以及山羊酪蛋白的调控序列(BCP)可以指导外源基因在乳腺中表达后,将BCP调控下的蚓激酶cDNA插入逆转录病毒载体,构建重组蚓激酶逆转录病毒载体,并进行包装,为以后利用此病毒感染山羊精原干细胞并在其后代中获得能高效表达蚓激酶这种昂贵药用蛋白的转基因山羊奠定基础.基于此,该实验用山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5区1.1kb调控序列和牛生长激素基因polyA(BGHpolyA),构建了蚓激酶乳腺表达载体(PBLK),并将表达载体注入泌乳期山羊乳腺进行暂时表达,采集注射前的对照乳样和注射后每隔一定时间的乳样,进行溶圈试验检测,结果表明,山羊奶中蚓激酶的表达量最高为20万t-PA IU/L.为下一步用显微注射法制备蚓激酶转基因小鼠模型和构建乳腺特异性重组蚓激酶逆转录病毒载体奠定了工作基础.将蚓激酶乳腺特异性表达盒(上游是山羊β-酪蛋白1.1kb调控序列,下游是蚓激酶cDNA,不含polyA),插入到逆转录载体的多克隆位点处,构建了重组蚓激酶逆转录病毒载体pLNCLK,将pLNCLK用脂质体介导转染逆转录病毒包装细胞PA317,用G418筛选得到五株细胞克隆Clonel、Clone2、Clone3、Clone4、Clone5.经PCR扩增鉴定为阳性后,取细胞上清,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,测得其最高滴度为6×10<5>cfu/ml.为下一步将蚓激酶重组逆转录病毒转染雄性山羊精原干细胞,制备蚓激酶转基因山羊奠定了基础.
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