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细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种,它主要由半胱氨酸蛋白酶介导执行,这类半胱氨酸蛋白酶被称为Caspase。细胞凋亡在细胞内稳态的维持,组织与器官发育以及免疫防御等方面都发挥着重要作用。目前在高等生物中,Caspase家族蛋白及其介导的凋亡调控通路已研究得较为透彻,而对无脊椎动物,尤其是软体动物的研究还十分有限。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,利用分子生物学、细胞生物学以及生物信息学等相关技术手段,对长牡蛎Caspase-3(命名为CgCaspase-3)、Caspase-8(命名为CgCaspase-8)的功能及其介导的凋亡调控机制进行了初步的研究。CgCaspase-3基因的开放阅读框(ORF)为924 bp,编码307个氨基酸,CgCaspase-8基因ORF全长为1455bp,编码484个氨基酸。CgCaspase-3和CgCaspase-8分子皆为酶原形式,包含典型的CASc结构域及酶活性位点。CgCaspase-3和CgCaspase-8 mRNA在各组织中皆呈组成性表达,且都在外套膜及血淋巴细胞中表达量较高,性腺中较低。在长牡蛎个体发育各个阶段(2细胞期-壳顶期),CgCaspase-3和CgCaspase-8 mRNA皆有表达,但表达模式不同。细胞内定位显示,Cg Caspase-3分子少量分布于细胞核中,而CgCaspase-8分子仅分布于细胞质中。CgCaspase-3酶原形式已具有催化活性,倾向于Asp-Xaa-Xaa-Asp(DXXD)形式底物。而Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO及Caspase家族蛋白酶泛抑制剂Z-VAD-FMK都对rCgCaspase-3酶活性有显著的抑制效果。胞内实验同样表明CgCaspase-3可以诱导细胞凋亡。此外,CgCaspase-3具有模式识别受体(PRR)的功能,LPS亲和层析、基于ELISA原理的LPS结合实验以及胞内共定位检测都表明CgCaspase-3可以直接结合LPS,而表面等离子共振(SPR)检测发现与LPS结合具有高度特异性,其解离常数(KD)为1.08×10-6 M,未检测到CgCaspase-3与磷壁酸、甘露聚糖及葡聚糖的结合活性。CgCaspase-3截短体重组蛋白rCgCas-3(NT)及rCgCas-3(ΔN58)与LPS结合能力均显著降低。体外检测环境下,LPS可以抑制rCgCaspase-3的活性,且呈现剂量效应。而胞内LPS同样可以抑制CgCaspase-3对底物(PARP)的水解活性,抑制细胞凋亡。CgCaspase-8分子对Caspase-8的底物(Ac-IETD-pNA)水解活性微弱,激活后,其活性有一定程度提高,并且rCgCaspase-3可在rCgCaspase-8作用下发生水解,形成约20 kDa和11 kDa小片段。CgCaspase-8可抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,其Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK对CgCaspase-8酶活性具有显著抑制作用。胞内共转染CgCaspase-3与CgCaspase-8实验表明,CgCaspase-3与CgCaspase-8完全共定位,两者可能存在相互作用。CgCaspase-8能够响应LPS、PGN及灿烂弧菌刺激,其中对LPS和灿烂弧菌刺激响应强烈。LPS刺激后,CgCaspase-8 mRNA及蛋白表达水平皆显著上升,后逐渐下降。而灿烂弧菌刺激,CgCaspase-8 mRNA表达量同样在3 h达到峰值,其后下降,而蛋白表达量则从0 h后逐渐降低,mRNA表达水平变化与蛋白水平不同。上述研究结果表明,与脊椎动物相比,长牡蛎Caspase家族成员Cg Caspase-3和CgCaspase-8分子在进化上高度保守,具有典型的CASc结构域及半胱氨酸水解酶活性,皆可介导细胞凋亡,并可响应不同的免疫刺激。同时研究发现长牡蛎存在特殊的凋亡调控机制,LPS可以抑制CgCaspase-3介导的细胞凋亡,这在其他高等生物及无脊椎生物中从未报道。这种特殊的调控机制可能在长牡蛎免疫防御中发挥重要作用。研究结果为深入研究无脊椎动物Caspase家族蛋白功能及凋亡调控机制奠定了重要基础。