动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是心血管病主要的病理基础,易损斑块破裂和继发性血栓形成是急性心血管事件发生后致死致残的主要原因。慢性脂源性炎症是AS重要的病理特征,是进展期斑块稳定性降低的重要病理机制之一,NLRP3炎性小体激活是诱发炎症反应重要的核心环节,是抗AS炎症研究的重要靶点。DNA甲基化的异常变化影响AS相关基因表达,诸多危险因素的致AS作用也与异常DNA甲基化有关。因此,将DNA甲基化研究引入AS,有助于在表观遗传学角度阐明AS复杂多基因异常表达的机制,DNA甲基化可逆性的特性对防治AS的药物研发也具有指引作用。课题组前期研究发现益气活血中药、活血解毒中药均具有调控AS异常甲基化的作用。中医理论认为AS具有虚瘀毒互结的病机特点,结合导师多年临证经验,人参虎杖复方作为益气活血解毒方药的核心组成具有抗AS的临床疗效,但其抗AS的药理作用和机制并不明晰。本课题通过液质联用技术及网络药理学方法预测人参虎杖复方抗AS作用机制,并以高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠构建AS小鼠模型、人参虎杖复方为干预药物,基于全基因组DNA甲基化及NLRP3炎性小体通路探讨人参虎杖复方对AS的调控效应及作用机制,旨在系统揭示人参虎杖复方在DNA甲基化层面的抗AS效应特点和作用机制。本博士论文分为以下两部分。第一部分基于液质联用和网络药理学预测人参虎杖复方抗动脉粥样硬化作用机制目的:借助液质联用技术和网络药理学方法初步预测人参虎杖复方潜在活性成分的作用通路和靶点,为后续实验提供研究方向。方法:（1）人参500g、虎杖600g水提冻干制备人参虎杖复方水提物,以超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS）对其进行成分鉴定,Swiss Target Prediction数据库设置Probability＞0对鉴定的化合物进行靶标预测;（2）在Gene Cards数据库重以“atherosclerosis”为关键词全面检索建立AS疾病靶点数据库,借助CytoScape软件对人参虎杖复方鉴定的化合物抗AS疾病靶点进行网络分析,在STRING数据库分析并构建靶点蛋白之间的相互作用（PPI）,最后进行KEGG通路富集并筛选相关通路的核心靶点。结果:（1）液质联用方法初步鉴定出人参虎杖复方水提物中共19个结构明确的化合物,包括（+）-儿茶素、白藜芦醇、顺式白藜芦醇、虎杖苷、大黄素蒽酮、大黄素、木犀草素、ω-羟基大黄素、人参皂苷Rf、山槐素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Ro、大黄素甲醚、决明酮、人参皂苷Re、20（S）-人参皂苷Rg2、芹菜素、人参皂苷Rg5,Swiss Target Prediction数据库预测筛选318个作用靶标。（2）Gene Cards数据库筛选到AS疾病靶点共4076个,与人参虎杖复方318个预测靶标交集的药物作用靶点共225个,以蛋白互作网络度值中位数2倍以上的靶点作为人参虎杖复方作用于AS的核心靶点,共有51个。（3）核心靶点KEGG通路富集后筛选P＜0.05的通路,炎症相关信号通路Toll样受体（TLR）信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路各有人参虎杖复方潜在作用的9个、8个、7个核心靶点,其中RELA是三条信号通路的共同靶点。结论:人参虎杖复方可作用于多条免疫炎症信号通路的多个靶点发挥抗AS作用,其中RELA编码蛋白NF-κBp65是桥接上游TLR信号通路和下游NOD样受体信号通路的关键靶点,人参虎杖复方通过TLR/NF-κB/NOD样受体信号通路介导的抗AS作用将在动物实验中进一步验证。第二部分人参虎杖复方抗小鼠动脉粥样硬化作用机制研究目的:从整体动物水平探讨人参虎杖复方对小鼠动脉粥样硬化以及全基因组DNA甲基化的干预作用,揭示其药效作用可能的表观遗传学机制。方法:（1）构建小鼠AS疾病模型及分组干预:85只7周龄左右雄性ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养9周构建AS模型,主动脉大体油红O染色观察到斑块形成为模型构建成功;将AS小鼠随机分为模型组（MC）、阳性对照组（辛伐他汀,SS）、人参虎杖复方水提物低剂量组（GPL）、中剂量组（GPM）、高剂量组（GPH）,相同遗传背景的C57BL/6J小鼠作为空白对照组（NC）;NC、MC组以饮用水灌胃,SS组予20mg辛伐他汀片的临床等效剂量0.026mg/（10g体重）,GPL、GPM、GPH各组分别予人参虎杖复方水提物临床等效剂量（4.94mg/（10g体重））、2倍（9.86mg/（10g体重））和4倍（19.72mg/（10g体重））临床等效剂量,灌胃干预12周后,进行指标检测。（2）评估人参虎杖复方抗小鼠AS的药效学作用:小动物血管超声检查左颈总动脉脉搏波传导速度（PWV）、主动脉弓下壁内中膜厚度（IMT）、左颈总动脉和主动脉舒缩期血管内径的差值（Dimer.s-Dimer.d,Ds-Dd）;大体主动脉油红O染色和主动脉窦病理切片HE染色观察斑块面积,主动脉窦病理组织切片油红O、Movat染色观察计算斑块各结构成分含量;全自动生化仪检测小鼠空腹血清TC、LDL-C、HDL-C、TG 含量,ELISA 法检测血清 IL-1β、MCP-1、SOD1、ox-LDL含量,WST-1法检测血清SOD活性。（3）分析人参虎杖复方对AS小鼠异常DNA甲基化的调控作用:对小鼠主动脉组织提取DNA并构建测序DNA文库,以全基因组甲基化捕获测序技术（Mc-Seq）检测小鼠主动脉全基因组DNA甲基化;以甲基化差异程度＞10%筛选差异甲基化CpG位点并对其进行基因注释,统计分析人参虎杖复方对AS小鼠异常DNA甲基化位点的调控作用,以焦磷酸测序验证人参虎杖复方对候选基因差异甲基化的调控作用。（4）明确人参虎杖复方对TLR/NF-κB/NOD样受体途径相关靶点表达的影响:选择小鼠主动脉样本,以Western blot法检测NLRP3炎性小体激活及上游TLR4/NF-κB信号通路相关靶点蛋白表达和磷酸化水平,Pearson法分析各靶点蛋白表达与血清IL-1β含量的相关性、候选基因NEK7 DNA甲基化与蛋白表达之间的相关性。结果:（1）人参虎杖复方对AS小鼠动脉血管弹性的影响:与模型组相比,人参虎杖复方高剂量组小鼠颈动脉PWV显著降低（P＜0.05）;人参虎杖复方低中高剂量组主动脉根部IMT均显著降低（P＜0.01）;人参虎杖复方低、中剂量组颈动脉血管内经差值显著增加（P＜0.05）。（2）人参虎杖复方对AS小鼠进展期斑块稳定性的影响:模型组AS小鼠大体主动脉油红O和主动脉窦病理切片HE染色见斑块形成,病理切片油红O染色显示斑块内有大量脂质蓄积,Movat染色示不稳定斑块形成,斑块易损指数较高。与模型组相比,人参虎杖复方低、中、高剂量组斑块面积未见显著改变（P＞0.05）;各组不稳定斑块面积明显较小,斑块易损指数均有不同程度显著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）;低、中剂量组斑块内泡沫细胞含量显著降低（P＜0.01）;高剂量组胶原和平滑肌细胞含量显著增多（P＜0.05）。（3）人参虎杖复方对AS小鼠血脂四项、炎症、抗氧化指标的影响:与模型组相比,人参虎杖复方低、中、高剂量组小鼠空腹血清TG含量显著降低（P＜0.05、P＜0.01）,高剂量组血清TC、LDL-C含量显著降低（P＜0.05）,各组血清HDL-C未见统计学差异（P＞0.05）;各组血清IL-1β含量显著降低（P＜0.01、P＜0.001）,中剂量组血清MCP-1含量显著降低（P＜0.01）;低、中剂量组血清ox-LDL含量显著降低（P＜0.05）;中剂量组SOD活性显著升高（P＜0.05）,高剂量组SOD1含量显著升高（P＜0.05）。（4）人参虎杖复方对AS小鼠全基因组异常DNA甲基化的调控:AS小鼠主动脉DNA异常高甲基化CpG位点比例高于异常低甲基化CpG位点比例（53.67%＞46.33%）,非intergenic区CpG岛异常高甲基化CpG位点占比73.22%,promoter区CpG岛异常高甲基化CpG位点占比为74.06%。人参虎杖复方低、中、高剂量组调控AS异常甲基化CpG位点比例分别为13.24%（10341/78122）、12.62%（9857/78122）、6.62%（5174/78122）;各组上调异常低甲基化位点占各自所调控 CpG 位点的比例分别为 46.63%（4822/10341）、49.99%（4928/9857）、51.33%（2656/5174）,上调位点的甲基化上调水平分别0.141±0.038,0.139±0.028,0.149±0.043,上调水平均有统计学差异（P＜0.01）;各组下调异常高甲基化位点占所调控位点的比例分别为 52.89%（5469/10341）、49.54%（4883/9857）、46.04%（2382/5174）,下调位点的甲基化下调水平分别0.124±0.021、0.128±0.021、0.13±0.025,下调水平均有统计学差异（P＜0.01）。在全部异常甲基化CpG位点调控方面,中、高剂量组均以上调异常低甲基化CpG位点比率高于下调异常高甲基化位点（P＜0.01）;在全部CpG岛、promoter区CpG岛、exon区CpG岛异常甲基化CpG位点调控方面,低、中、高剂量组均以上调异常低甲基化CpG位点比率显著高于下调异常高甲基化CpG位点（P＜0.01）。人参虎杖复方调控的差异甲基化CpG位点注释基因KEGG通路富集分析显示:P＜0.05、富集程度降序前20条通路包括雌激素信号通路、FcγR介导的吞噬作用通路、白细胞跨内皮迁移信号通路、Hippo信号通路、磷酸肌醇代谢通路、磷脂酰肌醇信号系统通路等,单条信号通路调控基因数比例最多达50%,调控基因数最多的通路是PI3K-Akt信号通路,61个基因甲基化在人参虎杖复方干预后发生变化,主要编码成纤维细胞生长因子受体家族、整合素家族、白介素家族等。（5）人参虎杖复方对AS小鼠候选基因异常DNA甲基化的调控:焦磷酸测序示:与模型组相比,人参虎杖复方低、中剂量组TRIL基因的3个测序位点甲基化水平显著上调（P＜0.01）,低剂量组FGFR3基因5个测序位点的甲基化水平均显著上调（P＜0.05）,高剂量组NEK7基因的1个测序位点甲基化水平显著上调（P＜0.05）。（6）人参虎杖复方对AS小鼠NLRP3炎性小体活化的影响:与模型组相比,人参虎杖复方低、中、高剂量组主动脉NLRP3、ASC/TMS1、caspase-1 p20蛋白水平显著降低（P＜0.01）,与血清IL-1β含量显著正相关（P＜0.001）。（7）人参虎杖复方对NEK7介导NLRP3炎性小体激活的影响:与模型组相比,人参虎杖复方低、中、高剂量组NEK7蛋白表达显著减少（P＜0.01）,与NEK7 DNA甲基化水平显著负相关（P＜0.001）,且NEK7蛋白表达水平与NLRP3炎性小体蛋白表达、血清IL-1β含量显著正相关（P＜0.001）。（8）人参虎杖复方对TLR4/NF-κB通路介导NLRP3炎性小体激活的影响:与模型组相比,人参虎杖复方低、中、高剂量组NF-κBp65蛋白表达及p-NF-κBp105/p50、p-IκBα、p-IKKα/β蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.01）,且均与降低NLRP3炎性小体活化具有显著正相关关系（P＜0.001）。结论:人参虎杖复方具有改善血管弹性的良好作用,通过增加斑块平滑肌、胶原含量显著降低斑块易损性,通过调脂、抗炎、增加抗氧化活性延缓了斑块进展;可双向调控AS小鼠全基因组异常DNA甲基化,以上调异常低甲基化作用显著;人参虎杖复方上调NEK7DNA甲基化、降低NF-κB途径介导的NEK7蛋白表达进而抑制NLRP3炎性小体活化可能是人参虎杖复方降低血清IL-1β含量而发挥抗炎作用的表观遗传学机制。