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核苷酸结合寡聚化结构域蛋白NOD1和NOD2是细胞内识别细菌的模式识别受体。NOD1和NOD2在哺乳动物中研究较多,在鱼类中却很少报道。在硬骨鱼类中,除了IFN-γ外,还有另外一个IFN-γ的同源物,称为IFN-γrel基因。IFN-γrel基因的研究只是在鱼类中有少量的报道。在本研究中,利用RACE和染色体步移方法扩增得到草鱼NOD1(gcNOD1)、NOD2(gcNOD2)及IFN-γrel(gcIFN-γrel)3个基因的cDNA以及基因组全长,同时研究了它们在感染草鱼呼肠孤病毒或注射脂多糖、聚肌胞甘酸、肽聚糖后的表达情况。该研究为进一步研究这些基因在抗微生物感染中的功能奠定了基础。
gcNOD1的cDNA长3215bp,开放阅读框包括2813 bp,编码937个aa,5’-非编码区长350 bp,3’-非编码区长52 bp。gcNOD2的cDNA包含3130 bp,开放阅读框包括2949 bp,编码982 aa,5’-非编码区长81 bp,3’-非编码区长103 bp。gcNOD1和gcNOD2结构与斑马鱼和哺乳类相似,主要由3个不同的结构域组成:(1)LRR:是富含亮氨酸的重复序列,位于NOD蛋白分子的C端,NOD1有2个LRR结构域,而NOD2有7个串联的LRR结构域；(2)NACHT:位于NOD分子中间；(3)效应结构域:位于NOD蛋白分子的N端,NOD1有一个CARD,NOD2有两个CARD。gcNOD1基因组由11外显子和10内含子组成,长度约9 kb;gcNOD2基因组长5 kb,由10个外显子和9个内含子组成。gcNOD1是一个非分泌型的蛋白质,没有信号肽；而gcNOD2却有一个长24个氨基酸的信号肽,预测在第24位丙氨酸和第25位谷氨酸之间剪切。经gcNODs与斑马鱼、人、猪和鼠的NODs比对可知,在脊椎动物的NOD的3种结构域中,NACHT最保守,NOD1基因中NACHT的相同性有58.0～92.5％,NOD2基因中NACHT的相同性有56.7～90.1％。从基因长度以及CARD、NACHT和LRR等结构域方面来比较,gcNOD1与其它物种的同种基因的相似性要高于NOD2的。
Real-time quantitative PCR显示,在健康草鱼的脑、肝脏,头肾、鳃、肠和血液等被检组织中,NOD1和NOD2都有表达。Real-time quantitative PCR检测,PGN、LPS、polyI:C能分别显著地诱导NOD1和NOD2基因在被检测的各组织中表达,但表达量有差异性。同时用Real-time quantitative PCR分析,经草鱼呼肠孤病毒GCRV诱导后,gcNOD1的表达在第1 d最高,然后逐渐减少；而gcNOD2最高表达出现在第2 d。免疫组化检测,gcNOD1基因在肠道、肝脏、脾脏、肾、脑及血液都有阳性信号。
gcIFN-γrel基因的cDNA全长861 bp,其中5’-非编码区长39 bp,开放阅读框长504 bp,编码167个aa,3’-非编码区长316 bp。3’-非编码区含AT(75.2％),含有5个ATTTA盒。一个潜在的多腺苷酸加尾信号AATAAA位于poly[A]尾上游13bp。gcIFN-γrel基因组全长约2 kb,由4个外显子和3个内含子组成。推测IFN-γrel蛋白含有一个长为24个氨基酸的信号肽序列。鱼类的IFN-γrel蛋白长166-171aa,比相应种类的IFN-γ(长180-194 aa)要短,即在C-末端缺少一个高级的核定位信号。gcIFN-γrel蛋白与其它已知鱼类的IFN-γrel有38-63％aa相同,有63-78％aa相似；而与其它鱼类的IFN-γ却只有18-22 aa相同和41-53％aa相似。利用鱼类IFN-γ和IFN-γrel的氨基酸序列构建系统发育进化树,gcIFN-γrel与斑点叉尾鲴、鲤鱼、斑马鱼的IFN-γrel进行比较,有76％支持率。
在分别注射LPS、PGN和polyI:C后,Real-time quantitative PCR检测结果显示,gcIFN-γrel在血液、头肾、中肾和脾脏等组织中都有表达。但在脾脏和中肾中,注射LPS引起gcIFN-γrel的表达量增加要比polyI:C的显著；相反,在血液和头肾中,注射polyI:C引起gcIFN-γrel的表达量增加要比LPS的显著；与LPS和polyI:C不同,PGN引起gcIFN-γrel的表达量最高出现在脾脏。用PGN同时诱导gcNOD1、gcNOD2和gcIFN-γrel,Real-time quantitative PCR检测显示,与gcIFN-γrel相似,gcNOD2的最高表达出现在脾脏,其次是血液、头肾和中肾；相反,gcNOD1的表达显著增长仅出现在脾脏。用GCRV诱导草鱼后,Real time PCR检测显示,在7 d内,gcIFN-γrel基因在脾脏都有表达,但最高量出现在第2 d。