骨骼是乳腺癌转移的常见部位,几乎在所有晚期乳腺癌患者中都有发现向骨转移的癌细胞。骨转移是影响肿瘤患者生活质量和生存的主要原因,它是多种因素相互作用的复杂过程。肿瘤细胞的骨转移始于原发性肿瘤脱离原发灶,侵袭进入血液循环或淋巴循环,黏附于目标内皮组织,迁移至转移部位骨并诱导血管生成以维持肿瘤生长。1994年Bellahcence首次阐述了骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein ,BSP)基因在易发生骨转移的人乳腺癌中表达[1]。BSP是SIBLINGs(small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins)家族成员之一,由细胞外基质中317个氨基酸组成的高度磷酸化和糖基化分泌性蛋白,平均分子量约75 kDa,其核心蛋白约33～34kDa。BSP在肿瘤的粘附、增殖、侵袭、基质降解、免疫反应(炎症和补体逃逸)、血管生成和转移中发挥重要的生物学作用,是治疗乳腺癌骨转移可能的药物靶点。因此深入研究BSP在乳腺癌骨转移中的机制,对乳腺癌的诊断与治疗具有重要意义。为了探讨以BSP为靶点的基因沉默在乳腺癌细胞侵袭、转移调控中的价值,本课题组的前期研究构建了针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293包装细胞,制备病毒悬液,然后感染亲骨转移乳腺癌细胞MDA-MB-231BO,通过嘌呤霉素筛选获得siRNA重组逆转录病毒稳定感染的乳腺癌细胞系,即231BO-BSP27和231BO-scrambled细胞,其中231BO-BSP27为BSP基因稳定沉默的乳腺癌细胞株。本研究在此基础上通过观察231BO-BSP27细胞的恶性侵袭表型包括细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭的改变,以及其在裸鼠体内的生长与转移情况,进一步探讨BSP基因沉默对乳腺癌细胞侵袭与转移的影响作用,为乳腺癌骨转移的基因治疗提供新的靶点。本实验的主要研究结果如下:1.实时荧光定量PCR检测显示231BO-BSP27细胞内BSP的mRNA表达抑制率为69%。2. Western-blotting检测表明231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为65%。3.免疫细胞化学方法检测结果表明未感染细胞MDA-MB-231BO和感染无关质粒细胞231BO-scrambled内BSP的表达呈强阳性,表达部位主要在胞浆,细胞核也有少量表达,BSP基因沉默的231BO-BSP27细胞内BSP的表达呈弱阳性。4.细胞生长曲线和平板克隆形成实验提示231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率均低于MDA-MB-231BO和231BO-scrambled细胞。5.细胞周期分布提示与MDA-MB-231BO和231BO-scrambled细胞相比,231BO-BSP27细胞的S期细胞数量明显减少,G0 /G1期细胞增多,即增殖活性受到抑制。6.细胞划痕实验和Transwell侵袭实验揭示231BO-BSP27细胞的迁移和侵袭能力均弱于MDA-MB-231BO和231BO-scrambled细胞。7.裸鼠骨组织X线检测结果显示部分裸鼠出现骨转移的现象;裸鼠组织切片HE染色结果揭示231BO-BSP27细胞的骨转移率明显低于MDA-MB-231BO和231BO-scrambled细胞;骨组织免疫组化的结果与其HE染色的结果一致,即骨组织中出现肿瘤细胞的部位,其BSP的表达也呈阳性。以上体内研究表明BSP基因沉默降低了乳腺癌细胞在裸鼠体内的骨转移发生率。