论文部分内容阅读
背景和目的乳腺癌是女性发病率最高的肿瘤,我国发病率为50.14/10万,且呈不断上升趋势。乳腺上皮细胞在多种致癌因子作用下发生基因突变,癌细胞出现并恶性增殖使乳腺组织正常结构被破坏,挤压并侵蚀周围正常组织,甚至威胁生命。然而及早发现诊断、早期治疗的患者生存率显著提高。目前,随着分子生物和免疫学技术的不断进步,对乳腺癌认识不断深入,在其早期诊断和治疗方面也取得了一定的进展。CD147是一种细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN),在人体细胞内分布广泛,涉及到不同的病理l生理过程,其中主要作用是参与细胞间及细胞与基质间的黏附。肿瘤组织中CD147异常激活,一方面可通过成纤维细胞刺激合成基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs),另一方面可与整合素作用家族形成蛋白复合物刺激MMPs的生成,进而降解Ⅳ型胶原,破坏细胞外基质,从而促进肿瘤的侵袭与转移。因此我们推测抑制CD147的表达可能抑制乳腺癌的浸润和转移。金属基质蛋白酶组织特异性抑制剂(the tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)能特异性抑制内源性的基质金属蛋白酶(MMPs),其既可以与MMP-2形成复合物而使后者失活,又可以阻止MMP-2与细胞表面接触从而抑制其活性,对其具有双重阻滞作用。正常情况下,MMP/TMP处于动态平衡状态。肿瘤癌变时MMP和TIMP表达都上调,但TMP上调程度不足以抑制MMP能力时,破坏ECM的动态平衡,促使肿瘤的浸润和转移。CD147基因为目前研究的热点,但是国内外关于利用RNA干扰靶向CD147基因研究乳腺癌的报道较少。本研究构建CD147慢病毒表达载体,转染到乳腺癌MDA-MB-231细胞中,观察其对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、增殖、迁移能力以及对MMP-2和TIMP-2mRNA和蛋白表达的影响,然后建立裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型,观察CD147siRNA对乳腺癌细胞成瘤的抑制作用。以此探讨CD147作为乳腺癌的治疗提供新的有效的靶点的可行性。方法1.免疫组化法检测MDA-MB-231细胞中CD147、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达。2.病毒滴度测定,构建CD147siRNA慢病毒载体并转染各实验组MDA-MB-231细胞(空白对照组、阴性对照组、CD147siRNA转染组),采用RT-PCR和Western Blot技术检测CD147siRNA转染MDA-MB-231细胞后不同时间点CD147mRNA和蛋白改变,确定最佳时间点。3. RT-PCR和Western Blot技术分别检测CD147siRNA转染MDA-MB-231细胞后MMP-2、TIMP-2的nRNA和蛋白改变。4.CCK-8法和划痕实验分别检测转染后各组MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力的改变。5.细胞悬液法建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察CD147siRNA对裸鼠瘤体体重和体积的影响。6.统计学分析:SPSS17.0软件处理,定量资料采用均数士标准差(Mean±SD)的形式表示,多组均数差异的比较采用单因素方差分析(ANOVA),显著水准a=0.05。结果1.免疫细胞化学实验结果显示,CD147蛋白、MMP-2蛋白、TIMP-2蛋白主要表达于MDA-MB-231细胞的胞膜/胞质中,呈棕黄色染色或颗粒状阳性表达。2.成功构建CD147siRNA;慢病毒载体,转染MDA-MB-231细胞后,CD147siRNA转染组中CD147mRNA和蛋白的表达量均下降,且具有时间依赖性,在72h时抑制率最高。3.转染MDA-MB-231细胞72h后,CD147siRNA转染组中MMP-2mRNA和蛋白的表达量也均下降;TIMP-2蛋白表达量下降,但其mRNA水平与对照组相比差异无统计学意义。4.CCK-8试验显示慢病毒转染MDA-MB-231细胞2d、3d、4d后,各组间细胞生长明显受到抑制,与对照组细胞生长抑制率比较差异具有统计学意义。5. CD147siRNA转染后的MDA-MB-231细胞迁移速度较小。6.沉默CD147基因,裸鼠瘤体体积和瘤体重量均下降,移植瘤的生长受到抑制。结论1.CD147可以影响MDA-MB-231细胞中的MMPs/TIMPs平衡。2.沉默CD147基因可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖和迁移及裸鼠移植瘤的生长。