基于酵母系统的ABI5家族保守区Ⅱ激活转录的机理研究

来源 :兰州理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zmz28859330
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ABI5及其亚家族成员是一类碱性亮氨酸拉链类转录因子,它们参与调控了脱落酸(ABA)信号转导过程中的许多生理生化过程如种子发育与萌发、各种生物及非生物胁迫的应答等。ABI5家族转录因子共有7个保守区,其中,保守区II在酵母细胞和植物细胞中具有转录激活活性。然而,存在于其两侧的序列即保守区I和保守区III可共同抑制保守区II的活性,对保守区I和保守区 III进行生物信息学分析时发现,在它们的氨基酸序列中存在有蛋白激酶SnRK2.6/OST1的磷酸化位点,SnRK2.6/OST1是ABA信号通路中一个发挥关键作用的蛋白激酶,保守区I和保守区III是否会响应ABA信号而解除对保守区II的抑制作用呢?本实验室最近对保守区Ⅱ进行了二级结构预测,结果显示,在其中部区域存在着一个仅由8个氨基酸残基组成的α-螺旋结构,这个α-螺旋结构是否具有独立的功能?它对保守区II的活性有何影响?ABI5结合蛋白(AFPs)是一类小分子蛋白,已知其家族成员有AFP1、AFP2、AFP3以及AFP4,它们也参与了ABA信号转导过程。本实验室前期的研究结果表明,当AFP4和ABI5亚家族最小的成员AtDPBF4/EEL共表达至酵母细胞时,AtDPBF4/EEL即可激活报告基因的表达,AFP4是如何激活或介导AtDPBF4/EEL的转录激活活性的呢?针对以上问题,本研究结果如下:  (1)利用拟南芥叶肉原生质体瞬时表达技术初步探究保守区I和保守区III是否响应ABA信号而解除对保守区Ⅱ的抑制作用,结果表明,在无ABA存在时,保守区I-II-III在植物细胞中存在一定的转录激活活性,这与酵母细胞中的结果有所不同;而在ABA存在时,保守区I-II-III在植物细胞中几乎没有转录激活活性,原生质体的总蛋白量也低于其它组,其原因尚不明确。  (2)利用酵母单杂交技术进一步分析保守区II中α-螺旋结构对其活性的影响,结果表明,当α-螺旋结构单独存在时,也能激活报告基因的转录,而且保持了完整保守区II大约75%的活性,本研究随后在酵母单杂交系统中对这8个氨基酸残基组成的α-螺旋结构进行了丙氨酸扫描突变分析和针对于破坏α-螺旋结构的点突变分析,结果显示α-螺旋结构中氨基端的前5个氨基酸残基中的任意一个氨基酸的改变都会导致保守区II活性的完全丧失,而且当α-螺旋结构被破坏时,保守区II的活性也完全消失,这表明α-螺旋结构中氨基端的前5个氨基酸残基和α-螺旋结构本身对保守区II的活性都是必需的,缺一不可。  (3)利用酵母双杂交技术初步研究AFP4和AtDPBF4/EEL的相互作用,结果表明,AFP4可以与 AtDPBF4/EEL中的保守区 I-II-III发生相互作用,而 AFP4与GAL4BD-I-II-III共表达至酵母细胞时,没有检测到转录激活活性,具体的分子机理有待进一步的深入研究。
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