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猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种以水样腹泻为主的急性、接触性猪肠道传染病,给养猪业带来了很大的危害。目前还无有效治疗措施,主要通过疫苗接种来预防该病的发生。乳酸杆菌因其耐酸、耐胆盐、安全的优点成为了最适合递呈抗原的活载体。研究表明,肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体,口服免疫后,在粪便、肠液和血清中均可检出sIgA抗体。仔猪可通过初乳获得母源sIgA,产生对PEDV的被动免疫保护。因此选择安全无毒、能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统,构建能够有效刺激黏膜免疫系统产生黏膜免疫应答的疫苗,对猪流行性腹泻病的防控具有重要意义。本研究构建了携带PEDV S1基因的重组表达质粒,成功在乳酸杆菌中表达出了S1蛋白并初步研究了表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组乳酸杆菌活载体疫苗的免疫原性。1 PEDV S1基因重组质粒的构建参考实验室PEDV EM-P株已测定序列,用生物信息学软件Protean对PEDV S1蛋白的疏水性、同源性、抗原表位进行分析,筛选出大小为307 aa的优势抗原作为目的蛋白,分别在目的基因的5’和3’端加上酶切位点Sal I和Eco R V,并进行密码子优化及基因合成,构建pUC57-S1克隆质粒,双酶切pVE5523载体和pUC57-S1,胶回收目的片段后进行连接,得到重组表达质粒pVE5523-S1,电穿孔转化至植物乳杆菌中,得到重组植物乳杆菌。分别用PCR、SDS-PAGE、蛋白免疫印迹进行鉴定,结果表明成功构建了重组植物乳杆菌,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹结果显示在植物乳杆菌中成功的表达出了分子质量约为34KD的外源蛋白。对重组菌和亲本菌进行生长曲线的绘制和耐酸性、耐胆盐分析,结果显示,外源质粒的转入没有明显影响细菌的生物学特性。将重组菌传代至第5代,研究其稳定性,经过PCR分析表明,直到第5代目的基因依然可以稳定的存在于重组菌中。2重组菌免疫原性的初步探究将含有红霉素的MRS培养基、浓度为10~9 CFU/mL的含质粒pVE5523植物乳杆菌和重组植物乳杆菌以0.2 mL的菌量灌服豚鼠进行安全性实验,结果显示各组间豚鼠均未出现不良临床症状,表明此菌量下口服安全。分别用含有红霉素的MRS培养基、含有表达质粒pVE5523的植物乳杆菌、含有重组质粒pVE5523-S1的植物乳杆菌口服免疫豚鼠三次,每次连续免疫三天,用PED-TGE二价弱毒苗大腿肌肉注射免疫豚鼠作为阳性对照组,免疫三次。在免疫后的0d、7d、14d、24d、31d、41d、48d采集粪便进行sIgA检测,同时心脏采血,分别用于进行ELISA抗体检测和中和试验分析。在48d无菌采豚鼠脾脏,进行脾细胞增殖实验。实验结果表明,该疫苗可刺激机体产生分泌性抗体sIgA和特异性中和抗体,同时还可促进机体表达IL-4和IFN-γ以及脾细胞的增殖。